单细胞和bulk转录组数据整合分析
识别MSS患者中具有高免疫浸润的亚群
对两个单细胞RNA测序数据集（GSE178341和GSE166555）进行细胞亚群注释，并整合28个bulk转录组数据集，使用TIS评分评估免疫浸润水平。
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多组学分析揭示改善MSS结直肠癌预后和免疫治疗耐药的特征
Multi-omics analysis reveals features improving outcomes and immunotherapy resistance in MSS colorectal cancer.
实验完整度
高整合单细胞和批量转录组数据，构建并验证预测模型，并在细胞系中进行功能实验验证CADM1机制。
主要模型
SW480结直肠癌细胞系 CT26结直肠癌细胞系 MSS结直肠癌患者队列（多中心bulk转录组数据） 单细胞转录组数据（GSE178341和GSE166555）
重点核对
CADM1敲低效率验证（siRNA） CCK-8细胞增殖实验 EdU细胞增殖实验 划痕愈合实验 Transwell迁移和侵袭实验
摘要
免疫学；生物信息学；生物信息学高性能计算；系统生物学；癌症系统生物学；癌症
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MSS结直肠癌患者中是否存在免疫浸润高、预后好且对免疫治疗响应的人群？其背后的分子机制是什么？
- 核心机制
- CADM1通过增强肿瘤细胞干性促进细胞增殖、侵袭和转移，从而影响MSS CRC患者的预后和免疫治疗耐药。
- 主要证据
- 基于多组学数据构建的MLDMPIS在多个独立队列中验证了预后和免疫治疗反应预测性能；在SW480和CT26细胞系中，敲低CADM1后细胞增殖、迁移和侵袭能力显著减弱，3D球体形成实验显示CADM1高表达组球体更大。
- 研究意义
- 该研究为MSS CRC患者的预后管理和免疫治疗选择提供了新的生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建MLDMPIS预后免疫特征
构建一个能够准确评估MSS患者预后和免疫治疗反应的机器学习模型
在TCGA-CRC队列中，利用20种算法组合（共93种组合）开发模型，并在meta队列中验证，选择C-index最高的组合（RSF和Ridge）作为最终模型。
验证MLDMPIS的预后性能
评估MLDMPIS在MSS患者中的预后预测能力
根据MLDMPIS评分将患者分为高风险和低风险组，进行Kaplan-Meier生存分析、多因素Cox回归分析，并比较MLDMPIS与临床指标和98个已发表预后模型的表现。
验证MLDMPIS的免疫治疗反应预测性能
评估MLDMPIS在预测免疫治疗反应中的有效性
在6个免疫治疗队列中，分析MLDMPIS评分与免疫治疗反应的相关性，并通过SubMap分析验证，并与40个已发表的免疫反应预测模型比较。
筛选MLDMPIS的恶性相关分子
识别MLDMPIS背后的关键功能驱动分子
通过计算基因表达与MLDMPIS评分的相关性，进行GSEA富集分析，筛选恶性相关基因，并与建模基因取交集，得到CADM1。
验证CADM1的恶性表型功能
验证CADM1对细胞增殖、迁移、侵袭和干细胞性的影响
在SW480和CT26细胞系中敲低CADM1，进行CCK-8、EdU、划痕愈合、Transwell和3D球体形成实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Biochannel | BC-SE-FBS01 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Scientific | L3000015 |
| 细胞增殖实验 | CCK-8细胞增殖和毒性检测试剂盒 | Solarbio | CA1210 |
| Cell-Light EdU Apollo567 体外试剂盒 | RiboBio | C10310-1 | |
| 细胞培养 | SW480细胞系 | Pricella | CL-0223 |
| CT26细胞系 | Pricella | CL-0071 | |
| 基因敲低 | CADM1 siRNA | Ribobio | -- |
| 基因表达检测 | TRIzon试剂 | CWbiotech | -- |
| HiFiScript cDNA合成试剂盒 | CWbiotech | -- | |
| LineGene-9600 Plus实时荧光定量PCR系统 | Bioer | -- | |
| 细胞固定和染色 | 结晶紫 | Solarbio | C8470 |
| Transwell实验 | 下室 | Corning | WG3422 |
| 3D球体形成实验 | 96孔超低吸附板 | ThermoFisher | -- |
| 显微镜观察 | E100显微镜 | CEWEI | -- |
| 扫描 | 3DHISTECH扫描仪 | 3DHISTECH | -- |
| 软件和算法 | R软件 | -- | R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系SW480和CT26的来源、培养条件（DMEM+10%FBS，37°C，5%CO2）、转染试剂（Lipofectamine 3000）及siRNA浓度 阅读提示：STAR★Methods中的'Cell culture and transient cell transfection' |
| 增殖实验 | CCK-8和EdU实验的具体操作步骤、孵育时间、检测波长等 阅读提示：STAR★Methods中的'Cell proliferation, transwell, wound healing and adhesion assay' |
| 迁移和侵袭实验 | Transwell实验中细胞接种密度、Matrigel包被、孵育时间（迁移实验和侵袭实验的具体时间） 阅读提示：STAR★Methods中的'Cell proliferation, transwell, wound healing and adhesion assay' |
| 划痕愈合实验 | 划痕宽度、观察时间点（0h和48h） 阅读提示：STAR★Methods中的'Cell proliferation, transwell, wound healing and adhesion assay' |
| 3D球体形成实验 | 细胞接种密度（2000细胞/孔）、培养条件（37°C，120rpm摇动）、Matrigel使用（仅SW480） 阅读提示：STAR★Methods中的'3D spheroid formation assay' |