患者队列建立与样本收集
收集临床样本，用于后续单细胞RNA测序、空间转录组测序和免疫组化染色分析，以探究M2a巨噬细胞与STAS的关系。
前瞻性队列纳入6例I期LADC手术患者（STAS阳性3例，STAS阴性3例），新鲜组织用于scRNA-seq，石蜡切片用于DSP空间转录组测序。回顾性队列纳入321例LADC手术患者，进行双免疫组化染色。
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基于单细胞和空间转录组学的研究揭示M2a巨噬细胞与肺腺癌肿瘤经气道播散的相关性
Single-Cell and Spatial Transcriptomics-Based Research Reveals Association Between M2a Macrophages and Tumor Spread through Air Spaces in Lung Adenocarcinoma
实验完整度
高包含单细胞RNA测序、空间转录组测序、双免疫组化染色、体外共培养、体内原位小鼠模型等多层级实验验证。
主要模型
人肺腺癌细胞系A549和H1975 THP-1来源的M2a巨噬细胞 原位肺癌小鼠模型（BALB/c-nu小鼠） STAS阳性及阴性的肺腺癌患者组织样本
重点核对
患者队列分为前瞻性队列（STAS阳性3例，STAS阴性3例）和回顾性队列（321例，其中STAS阳性146例，STAS阴性175例）。 M2a巨噬细胞与STAS状态及特征（最大距离、数量、实性巢型、微乳头型和单细胞型）的相关性。 体外共培养体系中THP-1细胞密度（2.5×10^5/mL，5×10^5/mL，1×10^6/mL）及AZD 2098（10 μmol/L）预处理。 CCR4阻断剂AZD 2098抑制M2a巨噬细胞对肺癌细胞迁移、脱落和侵袭的促进作用。 原位小鼠模型中，共移植组（肺癌细胞+M2a巨噬细胞）与对照组（仅肺癌细胞）的肿瘤病灶数量比较。
摘要
肿瘤经气道播散（STAS）是肺癌的一种病理特征，具有预后意义，也是肺癌临床领域的尖端热点。然而，目前肺腺癌（LADC）中STAS发生和定植的机制仍不清楚。本研究创新性地将单细胞RNA测序与数字空间分析（Digital Spatial Profiling）空间转录组测序相结合，这与STAS的空间特征和肿瘤微环境高度契合，旨在探讨特定类型的肿瘤相关巨噬细胞影响LADC中STAS发生和发展的机制。本研究提示，M2a巨噬细胞与LADC中的STAS和患者预后相关。M2a巨噬细胞可能通过趋化因子（C-C基序）配体17/CCR4轴促进β-catenin信号传导，从而增强LADC中的STAS。因此，靶向肿瘤相关巨噬细胞可能是STAS阳性LADC患者的一种有益的精准治疗策略。此外，肿瘤微环境表现出显著的空间异质性，在研究肿瘤时应充分考虑其空间特征。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探索特定类型的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在肺腺癌（LADC）中肿瘤经气道播散（STAS）发生和发展中的作用及机制。
- 核心机制
- M2a巨噬细胞通过CCL17-CCR4轴促进β-catenin信号传导，从而增强LADC细胞的EMT，进而可能促进STAS的发生和发展。
- 主要证据
- 主要证据来自单细胞RNA测序和空间转录组测序，以及体外共培养实验和原位小鼠模型。结果显示M2a巨噬细胞与STAS及不良预后相关，体外实验表明M2a巨噬细胞增强肺癌细胞迁移、脱落和侵袭能力，并上调EMT相关蛋白和β-catenin表达，这些效应部分可被CCR4阻断剂AZD 2098抑制。
- 研究意义
- 研究结果为STAS阳性LADC患者提供了潜在的精准治疗策略，即靶向肿瘤相关巨噬细胞，并强调在研究肿瘤时需要考虑肿瘤微环境的空间异质性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA测序分析
鉴定与STAS相关的关键巨噬细胞亚群。
对6例LADC组织进行scRNA-seq，分析细胞异质性，将巨噬细胞分为四个亚群（Mac_s1-4），比较STAS阳性与阴性组中各亚群比例，并分析关键基因表达。
双免疫组化染色及定量
验证M2a巨噬细胞在LADC组织中的浸润情况及其与STAS特征和预后的关系。
对回顾性队列的LADC石蜡切片进行CD206/甲状腺转录因子1双免疫组化染色，扫描为全切片图像，在肿瘤内部、边界和外部ROI中计数CD206阳性M2a巨噬细胞，并分析其与STAS特征及预后的相关性。
空间转录组测序分析
探究STAS相关区域（外部ROI）中肿瘤细胞的转录组特征和信号通路改变。
对6例样本的71个ROI进行DSP空间转录组测序，比较外部和内部ROI的差异表达基因，并进行富集分析和功能/通路签名分析。
M2a巨噬细胞的获取与鉴定
在体外获得并验证M2a巨噬细胞，用于后续共培养实验。
THP-1细胞经PMA（100 ng/mL）刺激48小时获得M0巨噬细胞，再用IL-4（20 ng/mL）处理48小时诱导M2a极化，通过流式细胞术检测CD206表达来验证。
体外共培养实验
评估M2a巨噬细胞对LADC细胞恶性生物学行为的影响，并验证CCL17-CCR4轴的作用。
将LADC细胞（A549和H1975）与不同密度的M2a巨噬细胞共培养，分为对照组、低、中、高M2a组和高M2a+AZD组，通过划痕实验、脱落实验、Transwell侵袭实验评估细胞迁移、脱落和侵袭能力，并通过ELISA检测CCL17浓度，通过Western blot检测EMT和β-catenin相关蛋白表达。
体内原位小鼠模型验证
在体内验证M2a巨噬细胞对LADC肿瘤生长和定植的影响。
BALB/c-nu小鼠随机分为对照组和共移植组，分别注射未共培养的A549细胞或共培养后的A549细胞与M2a巨噬细胞，21天后处死小鼠，取左肺进行HE染色并计数病灶数量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞RNA测序 | Chromium单细胞3'试剂盒版本3 | 10x Genomics | -- |
| Cell Ranger版本7.0 | 10x Genomics | -- | |
| 双免疫组化 | TTF-1抗体 | 北京中杉金桥 | ZM-0262 |
| CD206抗体 | Proteintech | 18704-1-AP | |
| iViewer版本7.2.7.2 | Vivotek | -- | |
| 空间转录组测序 | GeoMx DSP | NanoString Technologies | -- |
| GeoMx DSP NGS分析流程 | NanoString Technologies | -- | |
| 细胞培养 | THP-1细胞 | Procell | -- |
| A549细胞 | Procell | -- | |
| H1299细胞 | Procell | -- | |
| H1650细胞 | Procell | -- | |
| H1975细胞 | Procell | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| M2a巨噬细胞诱导 | 佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯 | -- | -- |
| 白细胞介素-4 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | FITC抗人CD206 | Proteintech | FITC-65155 |
| NovoExpress软件版本1.5.0 | Agilent Technologies | -- | |
| ELISA | 人CCL17 ELISA试剂盒 | Proteintech | KE00213 |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 核蛋白提取试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0027 | |
| CCR4抗体 | Abmart | TD10206S | |
| N-钙黏蛋白抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| 波形蛋白抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| β-连环蛋白抗体 | Proteintech | 51067-2-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 核纤层蛋白B1抗体 | Proteintech | 66095-1-Ig | |
| 药物处理 | AZD 2098 | 北京索莱宝 | IA5270 |
| 动物实验 | BALB/c-nu小鼠 | 北京华阜康 | -- |
| 异氟烷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列 | 前瞻性队列和回顾性队列的纳入标准、样本量（前瞻性3例STAS阳性、3例STAS阴性；回顾性321例，其中STAS阳性146例）、STAS判读标准（HE染色） 阅读提示：Materials and Methods: Patient Cohort |
| 单细胞RNA测序 | 组织消化和过滤条件、建库试剂盒版本、测序平台、比对参考基因组、质控参数（nFeature_RNA 200-7000，percent.mt<20%）、细胞注释方法 阅读提示：Materials and Methods: scRNA-Seq and Analysis |
| 双免疫组化染色 | 抗体（TTF-1，ZM-0262；CD206，18704-1-AP）、染色方法、ROI划分（2 mm边界）、计数方法（每个ROI随机选5个HPF，×400）、分组阈值（M2a中位数） 阅读提示：Materials and Methods: Evaluation of Whole-Slide Images of Double IHC Staining |
| 空间转录组测序 | ROI选择（71个）、荧光标记抗体（PanCK, CD68, CD206, SYTO13）、质控参数（minSegmentReads=1000, percentAligned=75, maxNTCCount=9000, minNuclei=20, % Segment cutoff=5%） 阅读提示：Materials and Methods: Digital Spatial Profiling Spatial Transcriptomics Sequencing and Analysis |
| M2a巨噬细胞诱导 | THP-1细胞来源、PMA浓度（100 ng/mL）和刺激时间（48小时）、IL-4浓度（20 ng/mL）和处理时间（48小时） 阅读提示：Materials and Methods: Acquisition and Co-Cultivation of M2a Macrophages |
| 体外共培养 | 肺癌细胞系（A549和H1975）、共培养密度（THP-1低2.5×10^5/mL，中5×10^5/mL，高1×10^6/mL）、共培养时间（48小时）、AZD 2098预处理浓度（10 μmol/L，4小时） 阅读提示：Materials and Methods: Acquisition and Co-Cultivation of M2a Macrophages |
| 功能实验 | 划痕实验（0, 24小时）、脱落实验（0.25% Trypsin-EDTA 1:5稀释，消化30和60秒）、Transwell侵袭实验（24小时，细胞数10^5） 阅读提示：Materials and Methods: Wound Healing Assays, Detachment Experiments, Transwell Invasion Assay |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c-nu，5周龄，雄性）、分组（对照组和共移植组，每组5只）、细胞注射量（10^6个细胞，共移植组含2.5×10^5 M2a）、注射体积（40 μL PBS-Matrigel 3:1）、处死时间（21天） 阅读提示：Materials and Methods: Orthotopic Lung Cancer Model and Animal Experiments |