体外验证TSLP变体对小鼠BMDC的信号活性
确定人TSLP变体能否通过小鼠TSLPR激活信号通路。
用lfTSLP或sfTSLP刺激WT和Tslpr–/– BMDCs，检测磷酸化STAT5表达。
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黏膜接种长效型TSLP通过诱导迁移性cDC1介导的适应性免疫抵抗SARS-CoV-2感染
Mucosal vaccination with long-form TSLP induces migratory cDC1-mediated adaptive immunity against SARS-CoV-2 infection.
实验完整度
高包含体外BMDC实验、体内小鼠免疫与攻毒实验、scRNA-seq转录组分析及条件性基因敲除小鼠等多层级验证
主要模型
C57BL/6小鼠（野生型） Tslpr–/–小鼠 CD11c-DTR小鼠 Tslprfl/fl;CD11c-Cre小鼠
重点核对
S1抗原剂量：3 μg（Genscript，Z03501） lfTSLP剂量：4 μg（Novoprotein，CK16） 免疫次数：3次，间隔10天 TSLPR信号：在cDC1中的条件性敲除 攻毒株：SARS-CoV-2野生型和Delta（B.1.617.2）
摘要
联合疫苗接种策略可能对有效控制病毒大流行至关重要。我们报告，用添加人胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）变体——长效型TSLP（lfTSLP）而非短型TSLP（sfTSLP）的商品化严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）亚单位疫苗经鼻内免疫小鼠，可诱导强烈的抗原特异性全身和黏膜抗体产生。lfTSLP在小鼠中的佐剂增强活性需要有功能的TSLP受体信号传导于迁移性1型常规树突状细胞（cDC1s）。此外，lfTSLP作用于迁移性cDC1s以增强滤泡辅助性T细胞（Tfh）和生发中心（GC）B细胞反应。经鼻接种含lfTSLP的疫苗可诱导持久的免疫原性，并保护小鼠免受野生型SARS-CoV-2和B.1.617.2变异株的攻击。我们的研究为lfTSLP的佐剂作用提供了见解，该作用对于增强迁移性cDC1介导的GC反应以提高疫苗效力至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究人TSLP变体lfTSLP和sfTSLP能否作为黏膜佐剂增强SARS-CoV-2亚单位疫苗的适应性免疫反应及其机制。
- 核心机制
- lfTSLP通过TSLPR信号作用于迁移性cDC1s，增强Tfh细胞和GC B细胞反应，促进抗体产生。
- 主要证据
- lfTSLP而非sfTSLP增强S1/RBD特异性IgG和IgA产生；cDC1耗竭或条件性敲除TSLPR消除该作用；scRNA-seq显示迁移性cDC1富集；攻毒实验显示保护作用。
- 研究意义
- 为lfTSLP作为黏膜佐剂的应用提供依据，有望用于病毒疫苗的合理设计与开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内免疫评价抗体反应
评估lfTSLP和sfTSLP作为佐剂对疫苗特异性抗体产生的影响。
小鼠经鼻免疫S1或RBD蛋白，加入或不加TSLP变体，检测血清IgG、IgG1、IgG2c和BALF中IgA水平。
检测中和抗体活性
评估lfTSLP佐剂诱导的血清中和抗体对SARS-CoV-2 WT和Delta假病毒及活病毒的中和能力。
采用假病毒和活病毒中和实验检测血清中和抗体效价。
验证TSLPR依赖性
确认lfTSLP增强抗体反应是否依赖于TSLPR信号。
比较WT和Tslpr–/–小鼠经S1+lfTSLP免疫后的抗体反应。
分析Tfh和GC B细胞反应
探究lfTSLP对Tfh细胞和GC B细胞分化的影响。
通过流式细胞术检测脾脏和淋巴结中Tfh细胞和GC B细胞的比例和数量。
评估DC亚群变化
确定lfTSLP作用的关键DC亚群。
通过单细胞RNA测序和流式细胞术分析淋巴结DC亚群。
验证cDC依赖性
证明lfTSLP的作用依赖于CD11c+ cDCs。
使用CD11c-DTR小鼠经白喉毒素处理耗竭cDCs，或使用Tslprfl/fl;CD11c-Cre小鼠特异性缺失DC上的TSLPR，后进行免疫并检测抗体和GC反应。
验证迁移性cDC1的必需性
证实迁移性cDC1是lfTSLP增强免疫效应的必需靶细胞。
使用Batf3–/–和骨髓嵌合小鼠（Tslpr–/–与Batf3–/–混合）进行免疫，检测抗体反应。
分析机制信号通路
探究lfTSLP激活迁移性cDC1的分子机制。
分析迁移性cDC1中非经典NF-κB信号通路相关分子表达，并用NIK抑制剂处理验证。
攻毒保护实验
评估lfTSLP佐剂疫苗对SARS-CoV-2 WT和Delta株的交叉保护作用。
免疫小鼠经Ad5-hACE2转导后，用WT或Delta株攻毒，检测病毒载量、病毒RNA和肺组织病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875500BT |
| DMEM培养基 | Gibco | 11995065 | |
| 细胞因子刺激 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | AF-315-03 |
| 白细胞介素-4 | Peprotech | AF-214-14 | |
| 细胞分选 | CD11c磁珠分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-125-835 |
| 免疫原 | SARS-CoV-2 S1蛋白 | Genscript | Z03501 |
| SARS-CoV-2 RBD蛋白 | Genscript | Z03483 | |
| 佐剂 | 短型TSLP | ChinaPeptides | -- |
| 长效型TSLP | Novoprotein | CK16 | |
| 药物处理 | 二甲基亚砜 | Solarbio | D8371 |
| NIK抑制剂 | MCE | HY-112433 | |
| 动物实验 | 白喉毒素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Procell | 164210-500 |
| 青霉素-链霉素 | Transgene | FG101-01 | |
| DC富集 | Dynabeads小鼠DC富集试剂盒 | Invitrogen | 114290 |
| 单细胞RNA测序 | 10x Genomics单细胞3'文库构建试剂盒v3 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq6000测序仪 | Illumina | -- | |
| ELISA | 96孔板 | Thermo Fisher | 446469 |
| 吐温-20 | Sangon | A100777 | |
| 牛血清白蛋白 | Solarbio | A8020 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗IgG抗体 | Invitrogen | 626520 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗IgG1抗体 | Invitrogen | A10551 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗IgG2c抗体 | Abcam | ab97255 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗IgA抗体 | Invitrogen | 626720 | |
| TMB底物 | Transgen | H101-01 | |
| SpectraMax 340PC酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD16/32抗体 | BioLegend | 93 |
| LIVE/DEAD可固定近红外死细胞染料 | Invitrogen | -- | |
| 抗CD11c抗体 | BioLegend | N418 | |
| 抗MHC-II抗体 | BioLegend | M5/114.15.2 | |
| 抗F4/80抗体 | BioLegend | BM8 | |
| 抗CD103抗体 | BioLegend | 2E7 | |
| 抗CD11b抗体 | BioLegend | M1/70 | |
| 抗CD8a抗体 | BioLegend | 53-6.7 | |
| 抗CD4抗体 | BioLegend | GK1.5 | |
| 抗CD44抗体 | BioLegend | IM7 | |
| 抗CXCR5抗体 | BioLegend | L138D7 | |
| 抗PD1抗体 | BioLegend | 29F.1A12 | |
| 抗CD19抗体 | BioLegend | 6D5 | |
| 抗GL7抗体 | BioLegend | GL7 | |
| 抗FAS抗体 | BioLegend | SA367H8 | |
| 固定/破膜试剂 | BD Biosciences | 554714 | |
| 抗IgG1抗体 | BioLegend | RMG1-1 | |
| 抗CD40抗体 | BioLegend | 3/23 | |
| 抗ICOSL抗体 | BioLegend | HK5.3 | |
| NovoCyte Advanteon流式细胞仪 | Agilent | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MCE | HY-K0010 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物I/II | MCE | HY-K0021, HY-K0022 | |
| 上样缓冲液 | Solarbio | P1040 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Beyotime | P0012AC | |
| PVDF膜 | Millipore | ISEQ00010 | |
| Western blot系统 | Guangzhou Daoyi | Basic 400 | |
| 抗NIK抗体 | Cell Signaling | 4994 | |
| 抗p100抗体 | Cell Signaling | 4882 | |
| 抗磷酸化p100抗体 | Cell Signaling | 4810 | |
| 抗RelB抗体 | Cell Signaling | 4922 | |
| 抗STAT5抗体 | Proteintech | 13179-1-AP | |
| 抗磷酸化STAT5抗体 | Cell Signaling Technology | 9351 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab213262 | |
| HRP标记的抗兔二抗 | Cell Signaling | 7074S | |
| ECL发光试剂 | Meilunbio | MA0186 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Takara | 9109 |
| Thermoscript RT-PCR系统 | Invitrogen | K1621 | |
| SYBR Green预混液 | Applied TransGen Biotech | AQ1141-04 | |
| 中和实验 | GFP-荧光素酶假病毒 | Genomeditech | GM-0220PV07, GM-0220PV45 |
| 表达hACE2的HEK293T细胞 | Abclonal | RM02456 | |
| 单荧光素酶报告检测试剂盒 | TransGen | FR101 | |
| SpectraMax Gemini XPS酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 病毒攻毒 | 兔抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗体 | Sino Biological | 40143-T62 |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-144 | |
| TrueBlue过氧化物酶底物 | KPL | -- | |
| ELISPOT读板仪 | Cellular Technology Limited | -- | |
| Vero E6细胞 | ATCC | CRL-1586 | |
| MagNA裂解仪 | Roche | -- | |
| 病理分析 | 正置白光显微镜 | Nikon | Eclipse E100 |
| 免疫组化 | Rodent Block-M封闭液 | Biocare Medical | -- |
| 兔抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白多克隆抗体 | Abclonal | a18797 | |
| DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 | Servicebio | G1212 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 免疫原与佐剂 | S1蛋白剂量：3 μg；RBD蛋白剂量：5 μg；lfTSLP剂量：4 μg；sfTSLP剂量：4 μg 阅读提示：见Materials and Methods中Immunization procedures |
| 免疫方案 | 免疫次数：3或4次；间隔时间：10天；给药途径：鼻内；麻醉方式：异氟烷 阅读提示：见Materials and Methods中Immunization procedures |
| 动物模型 | 小鼠品系：C57BL/6、Tslpr–/–、CD11c-DTR、Tslprfl/fl;CD11c-Cre、Tslprfl/fl;CD19-Cre、Baft3–/–；年龄：6-9周龄；性别：雌性 阅读提示：见Materials and Methods中Mice, viruses, and cells |
| 抗体检测 | 血清和BALF采集时间：第二次或第三次加强后第10天；ELISA终点滴度定义：OD值高于背景两倍 阅读提示：见Materials and Methods中ELISA |
| 流式细胞术 | Tfh细胞门控：CD4+ CD44+ CXCR5+ PD-1+；GC B细胞：CD19+ Fas+ GL7+；DC亚群：CD11c+ MHC-IIhi/low等 阅读提示：见Materials and Methods中Flow cytometry |
| 体内攻毒 | Ad5-hACE2转导剂量：2.5 × 10^8 FFU；攻毒剂量：5 × 10^4 FFU；攻毒时间：转导后5天；攻毒后取样时间：第2天 阅读提示：见Materials and Methods中SARS-CoV-2 challenge |