单细胞和空间转录组图谱构建
鉴定肝癌癌细胞的转录组异质性及空间分布。
对8例原发HCC、4例癌旁组织、7个小鼠肿瘤及12例原发HCC进行scRNA-seq和snRNA-seq，结合空间转录组测序，利用NMF分析识别功能原型。
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代谢原型癌细胞通过oxLDL介导的代谢相互作用在肝细胞癌中诱导促肿瘤TREM2+巨噬细胞
Metabolism archetype cancer cells induce protumor TREM2+ macrophages via oxLDL-mediated metabolic interplay in hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高整合单细胞、snRNA-seq、空间转录组及体外共培养、动物模型、类器官等多层级验证，涵盖功能验证与机制验证。
主要模型
人肝细胞癌组织样本及邻旁正常组织 小鼠自发肝癌模型（Ctnnb1-N90/sgTrp53） 代谢原型肝癌细胞系（Hepa1-6、Hep3B） 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）及TAM
重点核对
代谢原型癌细胞与TREM2+ TAMs空间共定位 SQLE表达与oxLDL生成及TREM2+ TAM浸润相关性 oxLDL通过TREM2-SYK-CEBPα轴诱导TREM2和SPP1表达 SPP1通过整合素和CD44介导对癌细胞和CD8+ T细胞的双重作用 靶向SQLE或TREM2可增强抗PD-1免疫治疗效果
摘要
癌细胞采用的功能程序及其对肿瘤微环境的影响是复杂的，目前仍不清楚。在此，我们确定了肝细胞癌（HCC）癌细胞中的三种不同的单细胞原型（即代谢、干性和炎症），每种原型都表现出独特的空间分布。进一步分析显示，由代谢原型癌细胞和TREM2阳性肿瘤相关巨噬细胞（TREM2+ TAMs）组成的免疫抑制微环境，加剧了免疫排斥并损害了患者预后。机制上，我们证明代谢原型癌细胞中上调的角鲨烯环氧化酶（SQLE）表达促进了氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）的生成。oxLDL通过TREM2-SYK-CEBPα轴诱导TREM2+ TAM极化，使这些TAMs能够促进癌细胞侵袭、抵抗效应细胞因子和CD8+ T细胞功能障碍。重要的是，癌细胞固有的SQLE和TREM2+ TAMs与人和小鼠HCC中较差的免疫治疗反应相关。我们的结果强调了癌细胞与TREM2+ TAMs之间oxLDL介导的代谢相互作用，为HCC免疫治疗提供了一个有前景的治疗途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肝细胞癌中癌细胞功能异质性如何影响肿瘤微环境，特别是代谢原型癌细胞如何与TREM2+ TAMs相互作用并影响免疫治疗反应。
- 核心机制
- 代谢原型癌细胞上调SQLE，促进脂质过氧化和oxLDL生成，oxLDL通过TREM2-SYK-CEBPα轴诱导TREM2+ TAM极化，后者分泌SPP1通过整合素和CD44分别作用于癌细胞和CD8+ T细胞，促进肿瘤进展和免疫治疗抵抗。
- 主要证据
- 单细胞及空间转录组分析显示代谢原型癌细胞与TREM2+ TAMs共定位；体外共培养和动物模型证实oxLDL诱导TREM2+ SPP1+ TAM极化及SPP1介导的促肿瘤和免疫抑制功能；靶向SQLE或TREM2可增强抗肿瘤免疫。
- 研究意义
- 揭示oxLDL介导的癌细胞与TREM2+ TAMs之间的代谢互作，为HCC免疫治疗提供潜在治疗靶点（如SQLE抑制）。作者提出特比萘芬（SQLE抑制剂）可能作为免疫治疗佐剂，但需进一步临床试验验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
代谢原型癌细胞与TREM2+ TAMs空间共定位分析
验证代谢原型癌细胞是否与免疫抑制性TAMs形成空间生态位。
使用Seurat和cell2location对空间转录组数据进行整合和反卷积，计算细胞类型共定位。
TREM2+ TAMs的临床相关性分析
评估TREM2+ TAMs与HCC患者预后及免疫治疗反应的关系。
分析TCGA-LIHC队列中TREM2+ TAM比例与预后关系；建立新辅助免疫治疗队列，比较ICB-R和ICB-NR肿瘤中代谢原型癌细胞和TREM2+ TAM比例。
TREM2+ TAMs功能验证及SPP1机制研究
验证TREM2+ TAMs的促肿瘤功能及SPP1介导的机制。
分选TREM2+/- TAMs与CD8+ T细胞或癌细胞共培养，检测CD8+ T细胞功能、癌细胞增殖迁移；验证SPP1抗体中和效应；动物共注射模型。
oxLDL诱导TREM2+ TAM极化及机制
验证oxLDL能否诱导TREM2+ TAM极化并揭示其分子机制。
用oxLDL处理BMDMs和TAMs，检测TREM2和SPP1表达；利用Trem2-/- TAMs、SYK抑制剂、CEBPα敲低等验证信号通路。
靶向SQLE的体内治疗效果
验证敲低SQLE是否能抑制肿瘤生长并增强抗PD-1疗效。
在Hepa1-6细胞中敲低Sqle，建立原位瘤模型，给予抗PD-1或特比萘芬治疗，检测肿瘤体积和TAM/CD8+ T细胞变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| BMDM分化培养基 | PeproTech | -- | |
| 人巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| 动物实验 | 抗PD-1抗体 | BioXCell | -- |
| 抗SPP1抗体 | BioXCell | -- | |
| 特比萘芬 | Targetmol | 80 | |
| 流式分析 | CD45抗体 | Biolegend | -- |
| CD8抗体 | Biolegend | -- | |
| TREM2抗体 | R&D Systems | -- | |
| Western blot | β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2128 |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| CEBPA抗体 | Cell Signaling Technology | 8178 | |
| SYK抗体 | Abmart | PA5788 | |
| 磷酸化SYK抗体 | Abmart | TA3314 | |
| DNMT3A抗体 | Cell Signaling Technology | 49768 | |
| CD36抗体 | Abmart | T55796 | |
| SQLE抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-54265 | |
| 免疫荧光 | SPP1抗体 | Abcam | ab214050 |
| TREM2抗体 | R&D Systems | MAB17291 | |
| CD68抗体 | Abcam | ab955 | |
| oxLDL抗体 | Abcam | ab14519 | |
| APOE抗体 | Cell Signaling Technology | 13366 | |
| CD44抗体 | Abcam | ab189524 | |
| SAA1+SAA2抗体 | Abcam | ab207445 | |
| ELISA | 小鼠SPP1 ELISA试剂盒 | Yobibio | U96-1583E |
| 人SPP1 ELISA试剂盒 | Yobibio | U96-1582E | |
| 小鼠oxLDL ELISA试剂盒 | Yobibio | U96-3617E | |
| 人oxLDL ELISA试剂盒 | Jianglai | JL12154 | |
| 脂质处理 | 氧化型低密度脂蛋白 | Invitrogen | -- |
| 低密度脂蛋白 | Invitrogen | -- | |
| 高密度脂蛋白 | Invitrogen | -- | |
| Bisulfite PCR | DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒 | Beyotime | D0068S |
| DNMT活性分析 | EpiQuik DNMT活性/抑制检测试剂盒 | Epigentek | P-3009-48 |
| 细胞活力 | CellTiter-Glo 3D试剂 | Promega | G9681 |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0037 |
| ChIP | ChIP试剂盒 | Active Motif | 53040 |
| 组织消化 | 人肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
| 小鼠肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | |
| 单核分离 | 细胞筛网 | Miltenyi Biotec | 130-110-915 |
| 单细胞测序 | Chromium单细胞3' V3试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| 类器官培养 | 小鼠类器官分离试剂盒 | Absin | abs9552 |
| 人肝癌类器官试剂盒 | Orgenbiotech | KOG02-HC | |
| 细胞活力 | 3D CellTiter-Glo试剂 | Promega | G9681 |
| 脂质去除 | Cleanascite脂质去除试剂 | Biotech Support Group | X2555-10 |
| 乳酸中和 | 碳酸钠溶液 | Macklin | S885117 |
| oxLDL摄取 | Dil标记氧化型低密度脂蛋白 | -- | -- |
| SSO（磺基-N-琥珀酰亚胺油酸酯） | -- | -- | |
| 脂质过氧化测量 | Image-iT脂质过氧化试剂盒 | Invitrogen | C10445 |
| NADP+/NADPH测量 | NADP+/NADPH检测试剂盒（WST-8） | Beyotime | S0179 |
| ROS测量 | ROS检测试剂盒 | Beyotime | S0033S |
| BCA蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010S |
| 质粒提取 | 无内毒素质粒大提试剂盒 | QIAGEN | 12362 |
| 质粒构建 | pX330-p53质粒 | Addgene | 59910 |
| pT3-N90-β-catenin质粒 | Addgene | 31785 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞测序 | 样本来源、数量、测序平台 阅读提示：Methods: Single-cell RNA sequencing, Single-nucleus RNA sequencing |
| 细胞培养 | 细胞系、培养基、血清浓度 阅读提示：Methods: Cells |
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、性别、注射细胞数、治疗剂量 阅读提示：Methods: Mice, Subcutaneous, orthotopic, co-injection, and spontaneous HCC model |
| 共培养实验 | 细胞比例、培养时间、处理条件 阅读提示：Methods: Co-culture experiments |
| oxLDL处理 | 浓度、时间 阅读提示：Methods: Lipid treatment of TAMs |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、稀释比例、染色步骤 阅读提示：Methods: Flow cytometry |
| 统计学分析 | 统计方法、样本量、重复数 阅读提示：Methods: Statistical analysis |