建立VS和BS小鼠模型
建立病毒性脓毒症（生存和致死）和细菌性脓毒症模型，以比较病理特征。
通过鼻内接种不同剂量PR8/H1N1病毒（10^3和10^5 PFU）和肺炎链球菌（2×10^6 CFU）建立模型，监测生存率和体重变化。
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甲型流感病毒播散和感染导致病毒性脓毒症中组织驻留细胞损伤和功能失调。
Influenza A virus dissemination and infection leads to tissue resident cell injury and dysfunction in viral sepsis.
实验完整度
高建立了VS生存/致死和BS小鼠模型，进行了病毒血症、活病毒分离、qRT-PCR、免疫荧光、单细胞转录组测序、功能验证（屏障通透性、siRNA敲低）等多层级实验。
主要模型
C57BL/6J小鼠（VS生存/致死模型） C57BL/6J小鼠（细菌性脓毒症模型） AML-12小鼠肝细胞系（siRNA敲低实验） MDCK细胞系（病毒扩增和中和实验）
重点核对
模型建立：鼻内接种PR8/H1N1流感病毒剂量（10^3和10^5 PFU）和Spn剂量（2×10^6 CFU） 病毒播散检测：血液和肺外器官（肝、脾、肾、心、脑）的病毒RNA和活病毒分离 单细胞测序：肺在1、2、3、5、7天，肝在3和7天的样本收集和混合 肝功能指标：ALT、AST的检测时间点和方法 siRNA敲低GNE验证：siRNA序列、递送方式、感染剂量和时间
摘要
背景：严重的呼吸道病毒感染可导致病毒性脓毒症（VS），这是一种以肺和肺外器官功能障碍为特征的危及生命的疾病。然而，VS 的病理机制尚不清楚。具体而言，尚不清楚细胞因子风暴和直接病毒感染如何导致肺外器官损伤。方法：在本研究中，我们通过鼻内给予 C57BL/6J 雄性小鼠不同剂量的 PR8/H1N1 流感病毒，建立了 VS 的生存和致死小鼠模型，并以肺炎链球菌引起的细菌性脓毒症（BS）作为参考。检查了病毒血症和病毒在肺外的播散和感染。在感染后不同天数（dpi）对三组的肺和肝脏进行了单细胞测序。发现：虽然细菌可以广泛传播和定植于肺外器官，导致多器官损伤，但 IAV 主要在肺细胞中复制并引起损伤。可在血液和肺外器官中分离到活病毒。通过血流播散，IAV 短暂感染肝脏和脾脏，导致肝功能障碍和脾脏萎缩，而不影响肾功能，尽管细胞因子水平系统性升高。与 BS 相比，VS 中肺内肺泡巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞，以及肝内内皮细胞和 Kupffer 细胞的比例下降更为显著。这伴随着更长时间的 PANoptosis 通路激活，以及上皮和内皮细胞中负责屏障功能和抗原呈递的基因下调。解释：我们的研究表明，H1N1 流感病毒通过血流播散并不同程度地感染肺外器官，这可能导致差异性的细胞死亡、器官功能障碍，并触发 VS。资助：本研究由国家自然科学基金（82241056, 82170015, 82030002, 82470007, 824B2001）、国家重点研发计划（2023YFC2306300）、中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2021-I2M-1-048）、国家中医药管理局创新团队和人才培养计划（ZYYCXTD-D-202208）、新基石科学基金会、国家高水平医院临床研究经费（2024-NHLHCRF-LX-01-0101, 2024-NHLHCRF-LX-01-0102）、北京研究病房卓越计划（BRWEP2024W114060103）、非传染性慢性病-国家科技重大专项（2023ZD0506200, 2023ZD0506203）和中央高校基本科研业务费、北京协和医学院（3332024193）资助。关键词：关键词：呼吸道病毒性脓毒症、细菌性脓毒症、肺炎、流感病毒、肺炎链球菌
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨流感病毒引起的病毒性脓毒症中，细胞因子风暴和病毒直接感染对肺外器官损伤的贡献及其机制。
- 核心机制
- H1N1流感病毒通过血流播散至肺外器官（肝、脾）并短暂感染，导致组织驻留细胞（肝内皮细胞、Kupffer细胞）比例下降，激活PANoptosis通路及下调屏障和抗原呈递相关基因，引起器官功能障碍。
- 主要证据
- 通过小鼠模型、病毒RNA和活病毒检测、单细胞测序、免疫荧光、siRNA敲低实验证实：病毒血症导致肝脾损伤，且肝细胞感染是肝功能异常的原因。
- 研究意义
- 研究表明流感病毒播散至肺外并感染靶细胞是引起肺外功能障碍的必要条件，提示抗病毒治疗和抑制PANoptosis、维持细胞功能可能成为治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测病毒血症和肺外器官播散
确定流感病毒是否通过血液传播至肺外器官并造成感染。
在不同时间点收集血液和肺外器官（心、肝、脾、肾、脑），通过qRT-PCR检测病毒RNA，通过鸡胚接种和空斑实验分离活病毒，并分离血液成分（PPP、血小板、血细胞）进行病毒检测。
评估肺外器官功能和组织病理
评估病毒感染对肺外器官（肝、肾、心）功能和结构的影响。
进行血液生化检测（ALT, AST, LDH, CK, CK-MB, UREA, CREA等）和H&E染色观察组织病理变化。
单细胞转录组测序分析肺和肝
揭示VS和BS中细胞组成和基因表达的动态变化，明确细胞死亡和功能失调的分子机制。
对肺（1, 2, 3, 5, 7 dpi）和肝（3, 7 dpi）组织进行单细胞RNA测序，分析细胞比例、转录组变化（包括PANoptosis、干扰素反应、屏障功能相关基因）。
验证病毒血症和器官损伤的关系
验证直接病毒感染在器官功能障碍中的作用。
通过尾静脉注射病毒模型、siRNA敲低GNE（影响唾液酸合成）等实验，结合肝功能指标变化，验证病毒感染对肝脏的直接作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒扩增和感染 | PR8/H1N1流感病毒 | ATCC | VR-95 |
| 甲型流感病毒(A/WS/1933(H1N1)) | ATCC | VR-1520 | |
| 甲型流感病毒(A/Wisconsin/67/2005(H3N2)) | ATCC | VR-1881 | |
| MDCK细胞系 | ATCC | CCL-34 | |
| TPCK处理的胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | 20233 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 琼脂糖 | -- | -- | |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 细菌培养 | Todd-Hewitt肉汤 | -- | -- |
| 酵母提取物 | -- | -- | |
| 胰蛋白胨大豆琼脂 | -- | -- | |
| 动物实验 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 碘化丙啶 | MedChemExpress | 00-4976-93 | |
| 脂多糖（大肠杆菌O111:B4） | Sigma-Aldrich | 93572-42-0 | |
| 细胞因子检测 | Bio-Plex Pro 小鼠细胞因子23重检测试剂盒 | Bio-Rad | M60009RDPD |
| 免疫荧光 | 抗核衣壳蛋白抗体 | Sino Biological | 11675-T62 |
| 抗NP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101352 | |
| 抗肺炎链球菌抗体 | abcam | ab20429 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H+L） | abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 488驴抗兔IgG（H+L） | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Alexa Fluor 555驴抗大鼠IgG（H+L） | Thermo Fisher Scientific | A48270 | |
| Alexa Fluor 555驴抗小鼠IgG（H+L） | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| DAPI染色液 | Yeasen | 40728ES03 | |
| 病毒分离 | EDTA采血管 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018CN |
| QIAamp病毒RNA小提试剂盒 | QIAGEN | 52904 | |
| RT-qPCR | HifairIII第一链cDNA合成试剂盒 | Yeasen | 11141ES60 |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| 屏障功能评估 | 伊文思蓝染料 | Sigma-Aldrich | 314-13-6 |
| 细菌载量测定 | 钢珠（直径3毫米） | Servicebio | G0103-200G |
| 单细胞悬液制备 | 小鼠肺解离试剂盒 | Miltenyi Biotech | 130-095-927 |
| 小鼠肝解离试剂盒 | Miltenyi Biotech | 130-105-807 | |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 | |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD可固定近红外（876）活力检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 2841589 |
| 染色缓冲液 | BioLegend | 420201 | |
| CD16/CD32封闭抗体 | BioLegend | 101320 | |
| CytoFLEX LX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| siRNA转染 | AML-12细胞系 | Procell | CL-0602 |
| siRNA-mate转染试剂 | GenePharma | G04026 | |
| opti-MEM培养基 | -- | -- | |
| 体内siRNA转染试剂 | GenePharma | G04031 | |
| 单细胞测序 | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 肝核分离 | 碘克沙醇 | Thermo Scientific | 36978 |
| RiboLock RNA酶抑制剂 | Thermo Scientific | -- | |
| PMSF蛋白酶抑制剂 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 模型建立 | 病毒株（PR8、H1N1(WS)、H3N2）和剂量（10^3、10^5 PFU）；细菌株（TH870）和剂量（2×10^6 CFU）；小鼠品系、年龄、性别、体重；麻醉方法（戊巴比妥钠45 mg/kg）；滴鼻途径和体积（30 μL） 阅读提示：Methods：Animal experiments |
| 病毒血症和器官播散检测 | 样本收集时间点（0-7 dpi）；血液分离方法（PPP、血小板、血细胞）；活病毒检测方法（鸡胚接种、空斑实验）；qRT-PCR检测的病毒RNA靶标（NP基因） 阅读提示：Methods：Isolation of the virus from mouse blood and extrapulmonary organs; RNA extraction and PCR analysis |
| 单细胞转录组测序 | 肺和肝脏样本收集时间点（肺：1,2,3,5,7 dpi；肝：3,7 dpi）；每样本混合的小鼠数量（3只）；组织解离试剂盒和条件；测序平台和文库制备试剂盒；生物信息学分析参数（Cell Ranger版本、Seurat版本、过滤阈值等） 阅读提示：Methods：Single-cell transcriptome sequencing of lung and liver samples; Analysis of single-cell RNA-sequencing data |
| 肝功能评估 | 血液生化检测指标（ALT、AST、LDH、CK等）和时间点；组织病理学（H&E）评估的器官和时间点 阅读提示：Methods：Animal experiments; Results: Establishment of models |
| siRNA敲低实验 | siRNA序列（siGNE_2）、递送方法（体内转染试剂）、剂量（40 μg）、感染剂量（10^5 PFU）和时间（24小时） 阅读提示：Methods：siRNA knockdown |