验证FBXO32与cyclin D1的物理相互作用
确定FBXO32是否是cyclin D1的相互作用蛋白
通过Co-IP、GST pull-down和SPR实验检测FBXO32与cyclin D1的结合及亲和力，并使用截短突变体确定相互作用结构域。
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F-box蛋白FBXO32泛素化并稳定D型细胞周期蛋白以驱动癌症进展
F-box protein FBXO32 ubiquitinates and stabilizes D-type cyclins to drive cancer progression.
实验完整度
高包含体外分子机制验证（泛素化、相互作用、半衰期）、细胞功能实验（增殖、迁移、侵袭）、体内动物模型（原位移植瘤、原发肝癌模型）及临床样本分析。
主要模型
Huh7人肝癌细胞系 CFPAC-1人胰腺导管腺癌细胞系 293T人胚肾细胞系 原位异种移植瘤小鼠模型（BALB/c裸鼠）
重点核对
FBXO32与cyclin D1的直接相互作用（GST pull-down、SPR、Co-IP） FBXO32介导cyclin D1 K27连接的泛素化（泛素突变体实验） cyclin D1 K58是FBXO32介导的泛素化位点（K58R突变降低泛素化） GSK-3β失活促进FBXO32介导的cyclin D1泛素化（抑制剂、siRNA、突变体） FBXO32敲低增强palbociclib对肿瘤生长的抑制作用（体内CCK-8和动物模型）
摘要
D型细胞周期蛋白（以下简称cyclin D）是调控G1/S细胞周期转换的核心调控因子。因此，cyclin D的异常表达与增殖相关疾病（如癌症）密切相关。然而，调控cyclin D转换的机制尚未完全阐明。在此，我们确定FBXO32（即atrogin-1）是靶向所有三种cyclin D进行泛素化和稳定的E3泛素连接酶。具体而言，FBXO32在K58位点催化cyclin D1的K27连接的多聚泛素化，并随后使其稳定。此外，GSK-3β失活介导的cyclin D1去磷酸化促进其与FBXO32的相互作用及随后的泛素化。此外，FBXO32在小鼠模型中表现出促肿瘤作用，且FBXO32升高与癌症患者的不良预后相关。另外，破坏FBXO32-cyclin D轴增强了细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）4/6抑制剂palbociclib的杀伤肿瘤效果。总之，这些发现揭示FBXO32通过K27连接的泛素化增强cyclin D的蛋白稳定性，并促进癌症进展以及癌细胞对CDK4/6抑制剂反应有限。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- D型细胞周期蛋白在癌症中如何失调，以及非降解性泛素化是否参与调控其稳定性。
- 核心机制
- FBXO32通过催化cyclin D1 K58位点的K27连接多聚泛素化来稳定cyclin D，而GSK-3β失活导致的cyclin D1去磷酸化促进其与FBXO32的相互作用。
- 主要证据
- FBXO32过表达增加cyclin D蛋白水平和半衰期，敲低则降低；K58R突变减弱FBXO32介导的cyclin D1泛素化；在肝癌和胰腺癌动物模型中FBXO32促进肿瘤生长和转移。
- 研究意义
- FBXO32-cyclin D轴在癌症进展中起关键作用，靶向该轴可能成为治疗FBXO32过表达癌症（如HCC、CCA和PDAC）的潜在策略，并增强CDK4/6抑制剂的疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测FBXO32对cyclin D蛋白水平和稳定性的影响
探索FBXO32是否通过泛素化稳定cyclin D蛋白
通过过表达和敲低FBXO32检测cyclin D蛋白水平，使用CHX追踪半衰期，并分析泛素化类型。
鉴定cyclin D1泛素化位点
确定FBXO32介导cyclin D1泛素化的具体赖氨酸残基
通过质谱分析鉴定潜在泛素化位点，并构建赖氨酸到精氨酸的突变体检测泛素化水平。
评估GSK-3β在FBXO32介导的cyclin D1泛素化中的作用
探究GSK-3β磷酸化状态对FBXO32与cyclin D1相互作用及泛素化的影响
使用GSK-3β抑制剂、siRNA和过表达突变体检测cyclin D1的泛素化水平。
验证FBXO32对肿瘤生长和转移的影响
在体内和体外评估FBXO32的促肿瘤作用
使用细胞增殖、迁移、侵袭实验以及原位异种移植和原发肿瘤小鼠模型检测FBXO32对肿瘤生长和转移的影响。
验证FBXO32介导的cyclin D稳定对CDK4/6活性和药物敏感性的影响
确定FBXO32上调cyclin D是否激活CDK4/6，并影响CDK4/6抑制剂疗效
检测cyclin D-CDK4/6复合物形成和Rb磷酸化，并进行palbociclib治疗实验。
分析临床样本中FBXO32与cyclin D1的相关性
评估FBXO32和p-GSK-3βSer9与cyclin D1在临床样本中的相关性及其预后价值
使用IHC染色检测HCC、PDAC和CCA组织样本中的蛋白表达，并进行相关性分析和生存分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子相互作用
验证蛋白稳定性
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | MG132 | Selleck | S2619 |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| 药物处理 | TWS119 | MedChemExpress | HY-10590 |
| AZ191 | MedChemExpress | HY-12277 | |
| 曲美替尼 | MedChemExpress | HY-10999 | |
| 酶活检测 | GSK3-β活性检测试剂盒 | GENMED | GMS50161.3.3 |
| 免疫荧光 | 多重免疫荧光染色试剂盒 | AiFang Biotechnology | AFIHC024 |
| 蛋白纯化 | GST标签蛋白纯化试剂盒 | Beyotime | P2262 |
| 泛素化实验 | Ni-NTA琼脂糖珠 | Qiagen | 30210 |
| 细胞周期分析 | 细胞周期检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 核糖核酸酶A | Sigma | -- | |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 质谱分析 | Q-Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Easy nLC液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| 表面等离子体共振 | BIAcore T200系统 | GE Healthcare | -- |
| CM5传感芯片 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| 体外激酶实验 | Cyclin D1-CDK4复合物 | MedChemExpress | HY-P702682 |
| Cyclin D1-CDK6复合物 | MedChemExpress | HY-P702687 | |
| Rb C端重组蛋白 | MedChemExpress | HY-P7S0127 | |
| 动物实验 | 二乙基亚硝胺 | Sigma-Aldrich | N0756 |
| 帕博西尼 | -- | -- | |
| Western blot | FBXO32抗体 | Abcam | ab168372 |
| 免疫荧光 | CK19抗体 | Abcam | ab52625 |
| CK7抗体 | Abcam | ab181598 | |
| Western blot | HA抗体 | Roche | 11867423001 |
| β-actin抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| α-Tubulin抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 免疫沉淀 | Cyclin D1抗体 | Proteintech | 60186-1-Ig |
| 免疫组织化学 | FBXO32抗体 | Proteintech | 67172-1-Ig |
| 免疫沉淀 | CDK4抗体 | Proteintech | 11026-1-AP |
| Western blot | GSK3β抗体 | Proteintech | 22104-1-AP |
| AMBRA1抗体 | Proteintech | 13762-1-AP | |
| FBXO31抗体 | Proteintech | 27294-1-AP | |
| APC/C抗体 | Proteintech | 10918-1-AP | |
| Cyclin D1抗体 | Cell Signaling Technology | 2978 | |
| 免疫组织化学 | Ki-67抗体 | Cell Signaling Technology | 9449 |
| 免疫沉淀 | CDK6抗体 | Cell Signaling Technology | 13331 |
| Western blot | p-RbS780抗体 | Cell Signaling Technology | 8180 |
| p-RbS795抗体 | Cell Signaling Technology | 9301 | |
| p-RbS807/811抗体 | Cell Signaling Technology | 8516 | |
| p-GSK3βS9抗体 | Cell Signaling Technology | 9323 | |
| Myc标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| β-TRCP抗体 | Cell Signaling Technology | 4394 | |
| SKP2抗体 | Cell Signaling Technology | 4358 | |
| 免疫沉淀 | 小鼠IgG同型对照 | Cell Signaling Technology | 5145 |
| Western blot | 兔IgG二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 |
| 小鼠IgG二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 大鼠IgG二抗 | Cell Signaling Technology | 7077 | |
| 免疫沉淀 | Flag抗体 | Sigma | F1804-1MG |
| 免疫荧光 | Cyclin D1抗体 | Santa Cruz | sc-450 |
| Western blot | Cyclin D2抗体 | Santa Cruz | sc-452 |
| Cyclin D3抗体 | Santa Cruz | sc-6283 | |
| Rb抗体 | Santa Cruz | sc-102 | |
| FBXL8抗体 | Santa Cruz | sc-390682 | |
| 免疫荧光 | FBXO32抗体 | ABclonal | A6825 |
| Western blot | FBXL2抗体 | ABclonal | A10296 |
| MG53抗体 | ABclonal | A16751 | |
| FBXO4抗体 | ABclonal | A9968 | |
| FBXW8抗体 | ABclonal | A18122 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基（DMEM+10% FBS）、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Methods 中的 Cell culture 小节 |
| 转染与处理 | 转染试剂（Lipofectamine 2000）、转染时间（48小时）、药物浓度（MG132 10 μM、CHX 100 μg/mL、TWS119 5 μM、AZ191 1 μM、trametinib 100 nM） 阅读提示：Methods 中的 Reagents and antibodies 和相应实验部分 |
| 基因敲低 | shRNA或siRNA序列、敲低效率、对照（sh-NC） 阅读提示：Methods 中的 Other materials and methods 和补充材料 |
| 蛋白相互作用 | 抗体（抗-Flag、抗-HA、抗-cyclin D1等）、IP条件（2 μg抗体、4-6小时、4°C）、洗涤条件 阅读提示：Methods 中的 Co-IP assay 小节 |
| 体内动物实验 | 细胞量（5×10^6）、裸鼠品系（BALB/c nude）、肿瘤体积计算公式、palbociclib剂量（100 mg/kg/天，口服14天）、AAV剂量（1×10^11病毒颗粒/鼠） 阅读提示：Methods 中的 Animal studies 小节 |
| 临床样本 | 样本数量（131例HCC、90例PDAC、89例CCA）、IHC评分标准、Spearman相关性分析、生存分析 阅读提示：Methods 中的 Patients and specimens 和 Statistical analysis 小节 |