改良苓桂术甘汤通过改善心肌梗死后大鼠线粒体损伤保护心室重构

Modified Linggui Zhugan Decoction protects against ventricular remodeling through ameliorating mitochondrial damage in post-myocardial infarction rats.

作者信息Mi Xiang, Xin Zhao, Yingdong Lu, Yang Zhang, Fan Ding, Lifei Lv, Yuling Wang, Zihuan Shen, Li Li, Xiangning Cui
PMID36704451
发布时间2023-01-10
DOI10.3389/fcvm.2022.1038523

实验完整度

包含SD大鼠MI模型和H9c2细胞OGD模型,通过超声心动图、组织学染色、TUNEL、Western blot、透射电镜等,进行功能验证和机制验证(SIRT3抑制剂3-TYP阻断实验)。

主要模型

SD大鼠MI模型(LAD结扎) H9c2心肌细胞OGD模型

重点核对

MI模型建立:SD大鼠LAD结扎 MLZD给药剂量:19.95 g/(kg·day),术后第1天开始,连续4周 OGD处理:无糖无血清DMEM,低氧(1% O2)4小时,复氧24小时 SIRT3抑制:3-TYP浓度1 μM 分组:大鼠分为Sham、MI、MLZD;细胞分为CON、OGD、3-TYP、OGD+3-TYP、MLZD、OGD+MLZD、OGD+MLZD+3-TYP

摘要

Introduction: Modified Linggui Zhugan Decoction (MLZD) is a Traditional Chinese Medicine prescription developed from Linggui Zhugan Decoction (LZD) that has been used for the clinical treatment of ischemic cardiovascular diseases. However, the cardioprotective mechanism of MLZD against post-myocardial infarction (MI) ventricular remodeling remains unclear.Methods: We explored the effects of MLZD on ventricular remodeling and their underlying mechanisms, respectively, in SD rats with MI models and in H9c2 cardiomyocytes with oxygen-glucose deprivation (OGD) models. The cardiac structure and function of rats were measured by echocardiography, HE staining, and Masson staining. Apoptosis, inflammation, mitochondrial structure and function, and sirtuin 3 (SIRT3) expression were additionally examined.Results: MLZD treatment significantly ameliorated cardiac structure and function, and thus reversed ventricular remodeling, compared with the control. Further research showed that MLZD ameliorated mitochondrial structural disruption, protected against mitochondrial dynamics disorder, restored impaired mitochondrial function, inhibited inflammation, and thus inhibited apoptosis. Moreover, the decreased expression level of SIRT3 was enhanced after MLZD treatment. The protective effects of MLZD on SIRT3 and mitochondria, nevertheless, were blocked by 3-TYP, a selective inhibitor of SIRT3.Discussion: These findings together revealed that MLZD could improve the ventricular remodeling of MI rats by ameliorating mitochondrial damage and its associated apoptosis, which might exert protective effects by targeting SIRT3.

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
MLZD是否能够改善心肌梗死后的心室重构,其作用机制是否与改善线粒体损伤和凋亡有关。
核心机制
MLZD通过促进SIRT3表达,改善线粒体结构破坏、保护线粒体动力学、恢复线粒体功能、抑制炎症,从而抑制线粒体相关的凋亡。
主要证据
在MI大鼠和OGD H9c2细胞模型中,MLZD改善心脏结构和功能、减轻纤维化、抑制心肌凋亡和炎症,修复线粒体损伤;SIRT3抑制剂3-TYP阻断了MLZD的保护作用。
研究意义
MLZD可能成为心肌梗死后心室重构甚至心力衰竭的新治疗选择。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

MLZD成分鉴定

鉴定MLZD中的潜在活性成分。

通过网络药理学和LC-MS分析,从10味中药中筛选出7个活性成分。

2

MI模型建立与MLZD干预

评估MLZD对MI后心室重构的影响。

SD大鼠LAD结扎建立MI模型,术后给予MLZD灌胃4周,通过超声心动图、HE染色、Masson染色评估心脏结构和功能。

3

心肌凋亡检测

检测MLZD对MI后心肌凋亡的影响。

通过TUNEL染色、Western blot和免疫组化检测凋亡相关蛋白表达。

4

心肌炎症检测

检测MLZD对MI后心肌炎症的影响。

通过Western blot检测炎症相关蛋白表达。

5

线粒体损伤评估

评估MLZD对MI后线粒体结构、动力学和功能的影响。

通过透射电镜观察线粒体超微结构,Western blot和免疫组化检测线粒体动力学和功能相关蛋白,检测MMP和SOD2水平。

6

SIRT3表达检测

探究MLZD对SIRT3表达的影响。

通过Western blot和免疫组化检测心肌组织和H9c2细胞中SIRT3表达。

7

SIRT3抑制剂验证

验证MLZD的保护作用是否依赖SIRT3。

使用SIRT3抑制剂3-TYP处理H9c2细胞,检测细胞活力、SIRT3表达、线粒体功能等。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证免疫效应
数据分析与统计

产品清单

实验环节名称品牌货号
沃特世Acquity超高效液相色谱Waters--
SIRT3抗体Cell Signaling2627S
抗线粒体融合蛋白2抗体Abcamab101055
磷酸化Drp1抗体Cell Signaling4867S
抗Bax抗体BOSTERBM3964
抗Bcl-2抗体Proteintech26593-1-AP
DAB检测试剂盒ZSGB-BIOZLI-9017
TUNEL试剂盒Roche--
H9c2细胞ProcellCL-0089
DMEM培养基Solarbio11995
胎牛血清Gibco16000044
链霉素-青霉素SolarbioP1400
无糖无血清DMEMGibco11966025
3-TYPSolarbioIT1960
CCK-8试剂盒DojindoCK04
大鼠细胞色素C氧化酶ELISA试剂盒RENJIEBIORJ16349
线粒体复合物I活性检测试剂盒SolarbioBC0515
ATP化学发光检测试剂盒ElabscienceE-BC-F002
四甲基罗丹明甲酯----
Omni-easy™一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒EpizymePG212
PVDF膜SolarbioYA1700/YA1701
脱脂奶粉Cell Signaling9999S
抗SIRT3抗体Cell Signaling2627S
抗SOD2/MnSOD抗体Abcamab16956
抗线粒体融合蛋白2抗体Abcamab101055
抗线粒体融合蛋白2抗体Biossbs-2988R
Drp1抗体Proteintech12957-1-AP
COX IV抗体Cell Signaling4850S
PGC-1α抗体Abcamab54481
PPAR-γ抗体WanleibioWL01800
细胞色素c抗体Cell Signaling11940S
cleaved caspase-3抗体Cell Signaling9664S
抗Bax抗体WanleibioWL01637
抗Bcl-2抗体WanleibioWL01556
NLRP3抗体NSJBIOR30750
ASC抗体Affinity BiosciencesDF6304
caspase-1抗体Santa Cruzsc-392736
NFκB p50抗体Abcamab32360
NFκB p65抗体Abcamab194726
IL-1β抗体Affinity BiosciencesAF5103
HRP标记的山羊抗兔IgG (H&L)Biossbs-40295G-HRP
山羊抗小鼠IgG (H&L)BeyotimeA0216
Gel Doc™ XR+凝胶成像系统Bio-Rad--
Clarity max Western ECL底物Bio-Rad1705062
GraphPad Prism软件(8.0版)----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
MI模型建立
LAD结扎位置、大鼠品系、性别、体重、麻醉剂量、术后分组
阅读提示:见2.2 Model induction of MI in rats
MLZD给药
给药剂量、给药方式、给药时间、药物制备
阅读提示:见2.3 Preparation of MLZD and interventions
超声心动图检测
麻醉剂量、检测参数、心动周期平均
阅读提示:见2.4 Echocardiography and specimen collection
OGD模型建立
细胞系、OGD时间、低氧条件、复氧时间
阅读提示:见2.7 Cell culture and treatments
SIRT3抑制实验
3-TYP浓度、处理时间
阅读提示:见2.7 Cell culture and treatments
线粒体功能检测
检测试剂盒、检测步骤、计算方式
阅读提示:见2.9 Measurement of mitochondrial electron transport chain complex I and IV, and ATP content