生物信息学筛选与表达验证
筛选乳腺癌中差异表达的lncRNA并验证LINC00702的表达水平及与预后的关系。
利用GEO数据集GSE54002分析差异表达lncRNA，用KMPLOT评估与生存的关系；通过RT-qPCR检测LINC00702在乳腺癌细胞系中的表达，并分析其亚细胞定位。
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敲低LINC00702通过Wnt/β-catenin通路抑制乳腺癌生长并诱导细胞凋亡
Knockdown of LINC00702 inhibits the growth and induces apoptosis of breast cancer through the Wnt/β-catenin pathway.
实验完整度
高包含生物信息学分析、细胞功能实验（CCK-8、EdU、凋亡检测）、体内异种移植瘤模型、机制验证（Western blot）及通路激活剂拯救实验等多个独立证据层级。
主要模型
乳腺癌细胞系BT-474和T-47D BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 GSE54002临床样本数据队列
重点核对
细胞系：BT-474和T-47D 敲低载体：Lv-shLINC00702-2 动物模型：BALB/c裸鼠，皮下注射5×10^6/mL细胞悬液100μL，32天后取材 通路激活剂：HLY78处理BT-474细胞 检测方法：CCK-8、EdU、Annexin V-APC/7-AAD、Western blot
摘要
长链非编码RNA（lncRNA）在细胞生长和凋亡等许多生物学领域至关重要。新发现的LINC00702的作用尚待探索。因此，我们希望通过生物信息学和各种方法阐明其在乳腺癌（BC）中的作用。通过生物信息学分析预测LINC00702的表达，并通过RT-qPCR进行验证。此外，评估了LINC00702敲低对BC进展的影响。高LINC00702水平可能导致BC患者预后不良。此外，CCK-8、EdU和Annexin V-APC7/AAD实验表明，LINC00702敲低抑制了BT-474和T-47D细胞的生长并促进了它们的凋亡。此外，体内实验表明，shLINC00702-2显著减小了肿瘤大小并抑制了c-Myc和β-catenin的表达。相反，拯救实验表明，Wnt/β-catenin通路的激活剂HLY78逆转了LINC00702敲低的细胞抑制作用。LINC00702是一种致癌lncRNA，通过刺激Wnt/β-catenin通路及下游蛋白促进BC进展，使其成为BC治疗进一步研究的有前景的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LINC00702在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌进展的影响和分子机制是什么？
- 核心机制
- LINC00702通过激活Wnt/β-catenin通路及其下游蛋白（β-catenin和c-Myc）促进乳腺癌细胞增殖并抑制凋亡。
- 主要证据
- 生物信息学分析显示LINC00702在乳腺癌组织中高表达且与预后不良相关；RT-qPCR验证其在乳腺癌细胞系中高表达。敲低LINC00702后，CCK-8和EdU实验显示细胞增殖受到抑制，Annexin V-APC/7-AAD实验显示凋亡增加；体内实验显示肿瘤生长受抑，且β-catenin和c-Myc表达下降；HLY78（Wnt/β-catenin激活剂）可逆转这些效应。
- 研究意义
- LINC00702是潜在的致癌lncRNA，可作为乳腺癌治疗的新靶点，为进一步研究乳腺癌治疗提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞功能实验（敲低LINC00702）
评估LINC00702敲低对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。
用shLINC00702-1和shLINC00702-2转染BT-474和T-47D细胞，通过CCK-8、EdU、Annexin V-APC/7-AAD和Western blot检测细胞活力、增殖、凋亡和Caspase 3表达。
体内异种移植瘤实验
验证LINC00702敲低在体内对乳腺癌肿瘤生长的影响。
将shLINC00702-2转染的细胞皮下注射到BALB/c裸鼠，测量肿瘤大小和重量，并通过RT-qPCR和IHC检测LINC00702、Ki-67和PCNA表达。
机制验证（Wnt/β-catenin通路）
探究LINC00702敲低是否通过Wnt/β-catenin通路影响乳腺癌细胞。
通过Western blot检测β-catenin和c-Myc表达，并在BT-474细胞中用HLY78（Wnt/β-catenin激活剂）处理，检测其对细胞增殖、凋亡及下游蛋白表达的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MCF-10A专用培养基 | Procell | CM-0525 |
| MEM培养基 | Procell | PM150410 | |
| RPMI 1640培养基 | Procell | PM150110 | |
| Leibovitz's L-15培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | WISENT | 085-060 | |
| 青霉素-链霉素 | NCM Biotech | c125c5 | |
| 细胞转染 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 动物实验 | 基质胶 | -- | -- |
| CCK-8检测 | CCK-8试剂盒 | Sigma | 96992-100TESTS-F |
| 凋亡检测 | Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒 | KeyGen Bio TECH | KGA1025 |
| EdU检测 | EdU | RIBOBIO | C10310 |
| 甘氨酸溶液 | Sigma | G8898 | |
| TritonX-100 | Sangon Biotech | A600198 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| Oligo dT引物 | -- | -- | |
| 随机引物 | -- | -- | |
| 免疫组化 | Ki-67抗体 | Proteintech | 27309-1-AP |
| PCNA抗体 | Proteintech | 10205-2-AP | |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010S | |
| Omni-Easy PAGE预制胶 | Epizyme Biotech | PG212 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| c-Myc抗体 | Proteintech | 10828-1-AP | |
| β-catenin抗体 | Proteintech | 17565-1-AP | |
| 山羊抗兔IgG | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 山羊抗小鼠IgG | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| SuperSignal West Pico化学发光底物 | Pierce Biotechnology | -- | |
| 通路激活 | HLY78 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：BT-474、T-47D、MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A；培养基种类及添加物：MCF-10A用Procell专用培养基，MCF-7用MEM，T-47D和BT-474用RPMI 1640，MDA-MB-231用Leibovitz's L-15，均含10% FBS和1%青霉素-链霉素；培养条件：37°C，5% CO2。 阅读提示：见Methods 2.1 |
| 细胞转染 | 转染载体：Lv-shNC和Lv-shLINC00702-2；转染时间：8小时，孵育48小时；筛选：嘌呤霉素筛选；细胞密度：1.2×10^6/孔（6孔板）。 阅读提示：见Methods 2.3 |
| 动物实验 | 动物品系：雌性BALB/c裸鼠，5-6周龄，18-20g；细胞悬液：5×10^6/mL，100μL皮下注射；观察周期：每5天测肿瘤大小，32天后处死。 阅读提示：见Methods 2.4 |
| 细胞功能检测 | CCK-8：细胞数5×10^3，检测时间0、24、48、72小时；EdU：浓度50μM，孵育2小时；凋亡检测：Annexin V-APC/7-AAD，孵育15分钟。 阅读提示：见Methods 2.5-2.7 |
| RT-qPCR | RNA提取：TRIzol；逆转录：Oligo dT和随机引物；扩增条件：95°C预变性2分钟，95°C变性15秒，60°C退火延伸30秒，共40循环；内参：GAPDH。 阅读提示：见Methods 2.8及表1 |
| Western blot | 蛋白提取：RIPA裂解液；定量：BCA法；抗体：c-Myc (#10828-1-AP)和β-catenin (#17565-1-AP)按1:5000稀释？原文未明确稀释比例，需核对原文；二抗：山羊抗兔IgG或抗鼠IgG（1:？）原文未明确，需核对原文。 阅读提示：见Methods 2.10 |
| 免疫组化 | 抗原修复：微波加热2.5分钟；一抗：Ki-67 (1:5000)，PCNA (1:800)；二抗稀释比：1:50，孵育20分钟；DAB显色。 阅读提示：见Methods 2.9 |