核糖体毒性应激诱导Snail1核仁积累
验证核糖体毒性应激是否促进Snail1在核仁中的定位
用HHT、anisomycin、puromycin、G418、blasticidin等处理HCC1806、SUM159、Hs 578T、A549等细胞，通过免疫荧光和细胞分级实验检测Snail1与核仁标志物B23的共定位
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USP36稳定核仁Snail1以促进核糖体生物发生和癌细胞在核糖体毒性应激下的存活
USP36 stabilizes nucleolar Snail1 to promote ribosome biogenesis and cancer cell survival upon ribotoxic stress.
实验完整度
高包括体外细胞实验、分子机制验证（Co-IP、泛素化、点突变）、体内异种移植瘤模型，多层次验证了JNK-USP36-Snail1轴的功能与机制。
主要模型
HCC1806细胞 HCC1806细胞异种移植瘤模型（BALB/c裸鼠） 白血病细胞系（K-562、OCI-AML2、MOLM-13）
重点核对
HHT浓度：20 ng/mL HHT处理时间：24小时 SP600125浓度：20 μM（体外），15 mg/kg（体内，腹腔注射） 异种移植瘤模型：HCC1806细胞5×10^5皮下接种于5周龄雌性BALB/c裸鼠，n=5/组 HHT体内给药：1 mg/kg，每日腹腔注射
摘要
使用核糖体抑制剂高三尖杉酯碱（HHT）靶向核糖体生物发生在白血病中有效，但在实体瘤中无效。在这里，作者证明在实体瘤中，HHT诱导的核糖体应激后JNK信号通路的激活促进Snail1在核仁中的积累，从而促进核糖体生物发生和对HHT的耐药性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 实体瘤对核糖体抑制剂HHT不敏感的原因及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- 核糖体毒性应激激活JNK-HSF1信号，上调去泛素化酶USP36，USP36通过其去泛素化酶活性稳定核仁Snail1（关键残基K146、K206），促进47S pre-rRNA表达和核糖体生物发生，从而促进癌细胞存活和对HHT的耐药。
- 主要证据
- 免疫荧光和细胞分级显示HHT诱导Snail1核仁积累；Co-IP证明USP36与Snail1结合；泛素化实验证实USP36去除Snail1 K48连接的泛素链；qPCR和Northern blot显示Snail1上调47S pre-rRNA；细胞凋亡和异种移植瘤实验表明抑制JNK-USP36-Snail1轴可增强HHT的抗肿瘤效果。
- 研究意义
- 该研究为靶向JNK-USP36-Snail1轴联合核糖体抑制治疗实体瘤提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定核仁Snail1的去泛素化酶USP36
寻找核仁中调节Snail1稳定性的去泛素化酶
通过数据库分析筛选核仁定位的DUBs，在HEK-293细胞中过表达候选DUBs检测对HA-Snail1蛋白水平的影响；通过Co-IP、泛素化实验验证USP36与Snail1的相互作用和去泛素化功能
鉴定Snail1的去泛素化位点及功能关键残基
确定USP36作用于Snail1的特异性泛素化位点及结合关键残基
通过质谱分析鉴定Snail1的泛素化位点K146和K206；通过突变体实验验证这些位点对USP36去泛素化和稳定化的必要性；通过蛋白对接和突变体实验鉴定K157为USP36-Snail1结合的关键残基
核糖体毒性应激通过JNK-HSF1上调USP36表达
阐明核糖体毒性应激诱导USP36表达的分子机制
使用JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580检测对HHT诱导的USP36表达的影响；通过ChIP实验验证HSF1结合USP36启动子；使用HSF1抑制剂KRIBB11验证HSF1对USP36的调控
评估核仁USP36-Snail1轴的功能
验证核仁Snail1对核糖体生物发生和细胞存活的作用
通过过表达或敲低Snail1/USP36检测47S pre-rRNA表达；通过敲低Snail1或USP36结合HHT处理，检测细胞凋亡（Annexin V/PI染色、cleaved caspase-3）；通过异种移植瘤实验评估体内肿瘤生长
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 高三尖杉酯碱 | Selleck Chemicals | S9015 |
| 茴香霉素 | Selleck Chemicals | S7409 | |
| 雷帕霉素 | Selleck Chemicals | S1039 | |
| G418 | Selleck Chemicals | S3028 | |
| 嘌呤霉素 | Selleck Chemicals | S7417 | |
| 杀稻瘟菌素 | Selleck Chemicals | S7419 | |
| SP600125 | Selleck Chemicals | S1460 | |
| SB203580 | Selleck Chemicals | S1076 | |
| MG132 | Selleck Chemicals | S2619 | |
| KRIBB11 | Selleck Chemicals | HY-100872 | |
| CX-5461 | Selleck Chemicals | S2684 | |
| 衣霉素 | Abcam | ab120296 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | SDS上样缓冲液 | Cell Signaling Technology | 7722 |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| Snail1抗体 | Cell Signaling Technology | 3895 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| p-p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9216 | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| p-JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| Tubulin抗体 | Cell Signaling Technology | 3873 | |
| SP1抗体 | Cell Signaling Technology | 5931 | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 5017 | |
| Cleaved-caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9654 | |
| Flag标签抗体 | Cell Signaling Technology | 8146 | |
| USP36抗体 | Proteintech | 14783-1-AP | |
| Western blot / 免疫荧光 | B23抗体 | ThermoFisher Scientific | MA5-12508 |
| Western blot | c-Myc抗体 | Abways | CY5150 |
| Western blot / ChIP | HSF1抗体 | Abways | CY9045 |
| Western blot | HSP70抗体 | Abways | CY5496 |
| E-cadherin抗体 | Abways | ab40772 | |
| His标签抗体 | Zen-Bio | 230001 | |
| 免疫共沉淀 | Anti-FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| Pierce Anti-HA磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88836 | |
| 免疫荧光 | Snail1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271977 |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 488二抗 | ThermoFisher | A-11029 | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 514二抗 | ThermoFisher | A-31558 | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂含DAPI | Cell Signaling Technology | 82961 | |
| qPCR | RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| SoFast EvaGreen Supermix | Bio-Rad | -- | |
| Northern blot | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| Hybond N+尼龙膜 | Roche | 11209272001 | |
| DIG-Easy Hyb缓冲液 | Roche | 11093657910 | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC | Beyotime | C1052 |
| 细胞活性检测 | CellTiter 96试剂盒 | Promega | -- |
| ChIP | ChIP-IT试剂盒 | Active Motif | -- |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G琼脂糖珠 | -- | -- |
| 质谱分析 | EASY-nanoLC 1000纳升液相色谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C18 ZipTip | Millipore | -- | |
| Western blot检测 | Bio-Rad ChemiDoc XRS+化学发光成像系统 | Bio-Rad | -- |
| 共聚焦显微镜 | Leica TCS SP5II共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| 流式细胞术 | BD FACScalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源、培养基、血清、抗生素浓度、药物处理浓度与时间、转染试剂 阅读提示：Methods: Cell culture and reagents; Cell culture conditions; Plasmids transfection |
| 药物处理 | HHT浓度20 ng/mL，处理时间24小时；其他药物浓度如anisomycin 50 ng/mL、SP600125 20 μM等 阅读提示：Figure legends for Fig. 1b, 2c, 7c, etc.; Methods: Reagents |
| 免疫荧光与共定位分析 | 抗体稀释、固定方法、共定位分析方法（Pearson相关系数）、细胞数量 阅读提示：Methods: Immunofluorescence staining; Figure legends for Fig.1, 2g, etc. |
| Western blot与Co-IP | 裂解缓冲液、抗体稀释、免疫沉淀条件（如NaCl浓度）、MG132处理时间与浓度 阅读提示：Methods: Western blot, co-immunoprecipitation |
| 泛素化检测 | 变性裂解缓冲液成分、MG132处理时间与浓度、His-Ub质粒构建 阅读提示：Methods: Snail1 ubiquitylation assays; Figure legends for Fig.3d-f |
| 核糖体生物发生检测 | qPCR引物、Northern blot探针、RNA提取方法、RNA上样量 阅读提示：Methods: Quantitative PCR and northern blot analyses; Figure legends for Fig.6c,d |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V/PI染色试剂、流式细胞仪、处理时间与浓度 阅读提示：Methods: Cell apoptosis and cell viability assays; Figure legends for Fig.6l, 7b |
| 动物实验 | 小鼠品系、周龄、性别、细胞接种数量、给药方式、剂量、频率、肿瘤测量方法 阅读提示：Methods: Ethics statement and mouse models; Figure legends for Fig.6r-t, 7g-k |