DNAJB4表达分析
验证DNAJB4在TNBC组织和细胞系中的表达水平。
通过qRT-PCR和Western blot检测正常乳腺细胞（MCF-10A）、乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-453、MCF-7）、四对TNBC组织及癌旁组织的DNAJB4表达；利用GEPIA数据库分析正常乳腺组织和乳腺癌组织的表达差异。
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DNAJB4通过激活Hippo信号通路促进三阴性乳腺癌细胞凋亡
DNAJB4 promotes triple-negative breast cancer cell apoptosis via activation of the Hippo signaling pathway.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（敲低/过表达、凋亡检测）、体内异种移植瘤模型及机制验证（Western blot检测Hippo通路蛋白磷酸化），证据层级独立。
主要模型
MDA-MB-231细胞 BT-549细胞 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 临床TNBC组织及配对癌旁组织
重点核对
DNAJB4敲低效率（shDNAJB4#2） 细胞凋亡检测（Annexin V-FITC/PI双染流式、Caspase3/7活性） Hippo通路蛋白磷酸化水平（p-MST1、p-LATS1、p-YAP） 异种移植瘤模型（细胞数量、注射方式、肿瘤体积测量） MST1抑制剂XMU-MP-1的使用
摘要
摘要
引言
三阴性乳腺癌（TNBC）是目前乳腺癌中最恶性的亚型，缺乏有效的靶向治疗。DNAJB4（DnaJ热休克蛋白家族（Hsp40）成员B4）是人类热休克蛋白家族（Hsp40）的成员。我们先前的研究已报道DNAJB4在乳腺癌中的临床意义。然而，DNAJB4在TNBC细胞凋亡中的生物学功能至今仍不清楚。
方法
通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法检测正常乳腺细胞、乳腺癌细胞、四对TNBC组织及配对的癌旁正常组织中DNAJB4的表达。通过一系列体外和体内的功能获得和功能丧失实验研究DNAJB4在TNBC细胞凋亡中的作用。通过蛋白质印迹法阐明TNBC细胞凋亡的潜在分子机制。
结果
DNAJB4在TNBC组织和细胞系中表达显著下调。DNAJB4敲低抑制了TNBC细胞凋亡并促进了体外和体内的致瘤性，而DNAJB4过表达则产生相反的效果。机制上，DNAJB4敲低通过抑制Hippo信号通路抑制TNBC细胞凋亡，而在DNAJB4过表达后该结果被逆转。
结论
DNAJB4通过激活Hippo信号通路促进TNBC细胞凋亡。因此，DNAJB4可能作为TNBC的预后标志物和治疗靶点。
补充信息
在线版本包含补充材料，可在10.1007/s12672-023-00645-y获取。
关键词
关键词：DNAJB4、TNBC、细胞凋亡、Hippo信号通路、生物标志物
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DNAJB4在TNBC细胞凋亡中的生物学功能及其潜在分子机制是什么？
- 核心机制
- DNAJB4通过激活Hippo信号通路（增加MST1、LATS1和YAP的磷酸化）促进TNBC细胞凋亡。
- 主要证据
- 体外敲低DNAJB4抑制细胞凋亡、促进致瘤性，过表达则相反；体内异种移植瘤实验显示敲低后肿瘤体积和重量增加；Western blot证实Hippo通路蛋白磷酸化水平变化。
- 研究意义
- DNAJB4可能作为TNBC的预后生物标志物和潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能获得与功能丧失实验
评估DNAJB4敲低和过表达对TNBC细胞凋亡的影响。
在MDA-MB-231和BT-549细胞中敲低DNAJB4（shRNA），在MDA-MB-231细胞中过表达DNAJB4（cDNA质粒），通过流式细胞术和Caspase3/7活性检测细胞凋亡，并通过Western blot检测凋亡相关蛋白表达。
体内异种移植瘤模型
验证DNAJB4敲低对TNBC致瘤性的影响。
将MDA-MB-231-shDNAJB4和shCtrl细胞皮下注射到BALB/c裸鼠，测量肿瘤体积和重量，并通过免疫组化检测Ki67和Cleaved Caspase3表达。
机制验证（Hippo信号通路）
阐明DNAJB4调控TNBC细胞凋亡的分子机制是否涉及Hippo信号通路。
通过Western blot检测DNAJB4敲低、过表达及添加MST1抑制剂XMU-MP-1后Hippo通路蛋白（MST1、LATS1、YAP）及其磷酸化水平的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | 8122138 | |
| Leibovitz's L-15培养基 | CELLCOOK | M210915 | |
| 胎牛血清 | LONSA SCIENCE SRL | SJ06513 | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone | SV30010 | |
| MCF-10A专用培养基 | Procell | CM-0525 | |
| 细胞转染 | DNAJB4敲低慢病毒 | OBiO | -- |
| DNAJB4过表达质粒 | OBiO | -- | |
| RNA提取与cDNA合成 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| cDNA合成 | 第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA浓度测定 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qRT-PCR | CFX-96系统 | BioRad | -- |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白浓度测定 | BCA蛋白测定试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | -- |
| 增强化学发光试剂 | Pierce | -- | |
| Tanon 5200成像系统 | Tanon | -- | |
| 抗DNAJB4抗体 | Invitrogen | PA5-49925 | |
| 抗MST1抗体 | Cell Signaling Technology | 14946 | |
| 抗LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | 3477 | |
| 抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| 抗磷酸化MST1抗体 | Cell Signaling Technology | 49332 | |
| 抗磷酸化LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | 8654 | |
| 抗磷酸化YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 13008 | |
| 抗Bax抗体 | Cell Signaling Technology | 5023 | |
| 抗Bak抗体 | Cell Signaling Technology | 12105 | |
| 抗Bcl-xS抗体 | Cell Signaling Technology | 2764 | |
| 抗Cleaved Caspase3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| 抗Bcl-2抗体 | Cell Signaling Technology | 15071 | |
| 抗Bax抗体 | Cell Signaling Technology | 41162 | |
| 抗Bcl-xL抗体 | Cell Signaling Technology | 2764 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A1978 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | Abcam | ab16667 |
| 抗Cleaved Caspase3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| 免疫纯金属增强DAB底物试剂盒 | -- | -- | |
| 机制验证 | XMU-MP-1 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养基组分（如MDA-MB-231使用L-15，BT-549使用RPMI-1640，MCF-7使用DMEM），血清浓度，培养条件（5% CO2，37°C） 阅读提示：Methods中Cell culture部分 |
| 基因操作 | 慢病毒敲低效率（shDNAJB4#2），质粒过表达效率，嘌呤霉素筛选浓度（4µg/ml）及时间（2周） 阅读提示：Methods中Cell transfection部分及Figure 2和3图注 |
| 凋亡检测 | 细胞处理时间，Annexin V-FITC和PI染色步骤，流式细胞仪检测参数，Caspase3/7活性检测试剂盒操作 阅读提示：Methods中Detection of apoptosis by flow cytometry部分及Figure 2和3图注 |
| 蛋白表达检测 | 抗体稀释比例，蛋白上样量，内参（β-actin），膜封闭条件，显影方法 阅读提示：Methods中Western blot assay部分 |
| 体内实验 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠），年龄（6周），每组数量（5只），注射细胞数（2×10^6），肿瘤测量公式及时间点（第35天处死） 阅读提示：Methods中Xenografted tumor model部分及Figure 4图注 |