鉴定BAF60c互作蛋白
探索BAF60c在鱼类中的潜在互作因子。
克隆大黄鱼baf60c基因，通过HIS-pull-down和LC-MS/MS鉴定互作蛋白，并进行KEGG和GO富集分析。
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探究SWI/SNF复合物亚基BAF60c在鱼类脂质代谢和炎症中的作用
Exploring the role of SWI/SNF complex subunit BAF60c in lipid metabolism and inflammation in fish.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（巨噬细胞、肝细胞）和体内动物实验（大黄鱼），并结合HIS-pull-down、LC-MS/MS、RNA-seq、Co-IP、Western blot及功能敲低/过表达验证，证据层级完整。
主要模型
大黄鱼原代肝细胞 大黄鱼巨噬细胞系 HEK293T细胞 大黄鱼幼鱼（体内实验）
重点核对
BAF60c-siRNA处理巨噬细胞和肝细胞36小时 BAF60c过表达处理肝细胞24小时 GRP78激动剂BiP和抑制剂HM03处理巨噬细胞，浓度10 μM dsRNA-BAF60c腹腔注射剂量2 μg/(g b.w)，处理36小时 高脂饮食（18%粗脂肪）饲喂10周
摘要
生物科学；动物学；生理学；分子生物学
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BAF60c在鱼类中是否通过与GRP78互作参与脂质代谢、内质网应激和炎症的调控？
- 核心机制
- BAF60c与GRP78相互作用并正向调控其表达，进而促进脂肪酸合成、内质网应激和炎症反应；敲低BAF60c或GRP78均降低这些过程。
- 主要证据
- 通过HIS-pull-down和LC-MS/MS鉴定互作蛋白，Co-IP和共定位验证BAF60c与GRP78互作；RNA-seq显示脂肪酸合成通路下调；体外敲低/过表达及体内dsRNA注射实验证实BAF60c和GRP78调控脂质代谢、ER应激和炎症相关基因表达。
- 研究意义
- 首次在鱼类中揭示BAF60c与GRP78的相互作用及其在脂质代谢和炎症中的功能，丰富BAF60c互作蛋白网络，为缓解高脂饮食诱导的异常脂质沉积和炎症提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证BAF60c与GRP78的相互作用
确认BAF60c与GRP78是否直接结合。
在HEK293T细胞中共表达BAF60c-HA和GRP78-FLAG进行Co-IP，共表达BAF60c-GFP和GRP78-RFP观察共定位。
检测BAF60c对GRP78表达的调控
探究BAF60c是否影响GRP78的表达。
在巨噬细胞和肝细胞中通过siRNA敲低BAF60c或过表达BAF60c，检测grp78 mRNA和蛋白水平；并用GRP78激动剂BiP和抑制剂HM03处理，观察对BAF60c表达的影响。
转录组分析BAF60c的整体效应
揭示BAF60c敲低后基因表达的整体变化。
对BAF60c-siRNA处理的肝细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因并进行GO和KEGG富集。
体外验证BAF60c功能
验证BAF60c对脂质代谢、ER应激和炎症的影响。
在巨噬细胞和肝细胞中敲低或过表达BAF60c，检测ER应激、炎症和脂质代谢相关基因表达及GRP78、JNK、ERK蛋白水平。
体内验证BAF60c功能
在活体水平验证BAF60c对脂质合成、ER应激和炎症的作用。
对大黄鱼幼鱼腹腔注射dsRNA-BAF60c，检测肝脏脂质代谢和炎症基因表达、肝甘油三酯水平、头肾ER应激和炎症基因表达，并通过透射电镜观察肝细胞脂滴和ER结构。
GRP78功能验证
验证GRP78是否介导与BAF60c相似的功能。
在巨噬细胞和肝细胞中用siRNA敲低GRP78，检测ER应激、炎症和脂质代谢相关基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 兔多克隆抗BAF60c抗体 | -- | -- |
| 兔单克隆抗GRP78抗体 | Cell Signaling Technology | 3177 | |
| 兔多克隆抗JNK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 兔单克隆抗磷酸化JNK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| 兔多克隆抗eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 9722 | |
| 兔多克隆抗磷酸化eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 9721 | |
| 兔单克隆抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 兔单克隆抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 兔单克隆抗DYKDDDDK标签抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 兔单克隆抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 小鼠多克隆抗GAPDH抗体 | Golden Bridge Biotechnology | TA-08 | |
| 菌株 | 大肠杆菌DH5α | TransGen Biotech | CD201-01 |
| 药物处理 | Bip诱导剂X | MedChemExpress | HY-110188 |
| HM03 | MedChemExpress | HY-125974 | |
| 转染 | EZ Trans转染试剂 | LIFE iLAB | AC04L099 |
| dsRNA合成 | TranscriptAid T7体外转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K0441 |
| 细胞培养 | HEK293T细胞系 | ATCC | CRL-3216 |
| 质粒构建 | pcDNA3.1(+)载体 | Miaoling Bio | P0157 |
| pCS2+载体 | KeLeiBio | kl-zl-0892 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Takara | -- |
| 反转录 | PrimeScript反转录试剂盒 | Takara | -- |
| qPCR | SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒 | Takara | -- |
| qPCR仪器 | 定量热循环仪 | Bio-rad | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| Beyo ECL Plus化学发光试剂 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| TG测定 | 甘油三酯测定试剂盒 | Applygen Technologies Inc | -- |
| RNA测序 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| NanoDrop 2000微量分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Illumina HiSeq X10测序仪 | Illumina | -- | |
| Co-IP | Pierce ANTI-HA琼脂糖珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ANTI-FLAG M2亲和凝胶 | Sigma | -- | |
| IgG琼脂糖珠 | Sigma | -- | |
| HA肽 | MedChemExpress | -- | |
| Flag肽 | MedChemExpress | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Vivacell | -- |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | P1400 | |
| 0.25%胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 基因克隆 | ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 大黄鱼原代肝细胞分离和培养条件（28°C，15% FBS），巨噬细胞系培养密度（1.0×10^6 cells/ml），BAF60c-siRNA和过表达处理时间（敲低36h，过表达24h），GRP78激动剂/抑制剂处理浓度（10 μM）和时间。 阅读提示：STAR★Methods - Cell culture and treatment |
| 体内实验设计 | 大黄鱼幼鱼来源，饲料脂质水平（对照组12%，HFD组18%），饲喂时间（10周），dsRNA-BAF60c注射剂量（2 μg/(g b.w)）和处理时间（36h），取样组织（肝脏和头肾）。 阅读提示：STAR★Methods - Animals and diets |
| 互作验证实验 | HIS-pull-down使用大黄鱼肝脏蛋白与Ni-beads结合的HIS-BAF60c孵育，LC-MS/MS分析；Co-IP使用HEK293T细胞共转染BAF60c-HA和GRP78-FLAG 24h，裂解后与ANTI-HA/FLAG琼脂糖孵育4h。 阅读提示：STAR★Methods - HIS-pulldown, LC-MS/MS analysis, Coimmunoprecipitation |
| 转录组测序 | 肝细胞BAF60c-siRNA处理36h，RNA提取和测序平台（Illumina HiSeq X10），生物信息学分析平台（Majorbio Cloud Platform）。 阅读提示：STAR★Methods - HIS-pulldown, LC-MS/MS analysis, RNA sequencing |
| 基因表达检测 | qRT-PCR内参基因（β-actin），数据分析方法（2^−ΔΔct），统计方法（独立t检验，mean±SEM，n=3）。 阅读提示：STAR★Methods - RNA isolation and quantitative real-time PCR, Quantification and statistical analysis |