检测TRIM65表达与临床相关性
明确TRIM65在肾癌组织和细胞中的表达水平及其与预后的关系
利用TCGA数据库分析TRIM65 mRNA表达；Western blotting检测RCC细胞系中的蛋白水平；免疫组化检测临床组织样本中的表达，并分析其与患者生存的关系。
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TRIM65通过泛素化降解BTG3促进肾细胞癌
TRIM65 promotes renal cell carcinoma through ubiquitination and degradation of BTG3.
实验完整度
高包含体外细胞增殖、软琼脂克隆形成、异种移植瘤模型、以及机制验证（Co-IP、GST pull-down、泛素化分析）和临床样本验证。
主要模型
ACHN细胞 769-P细胞 Caki-1和Caki-2细胞 裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
TRIM65在RCC细胞系中的表达水平（ACHN、769-P、Caki-1、Caki-2） TRIM65敲低或过表达后细胞增殖能力的变化 TRIM65与BTG3的相互作用（酵母双杂交、Co-IP、GST pull-down） BTG3 K41位点对TRIM65介导的泛素化和降解的影响
摘要
作为一种典型的E3连接酶，TRIM65（tripartite motif containing 65）参与抗病毒先天免疫的调节和某些肿瘤的发病机制。然而，TRIM65在肾细胞癌（RCC）中的作用及其潜在机制尚未确定。在本研究中，我们将TRIM65确定为RCC中的一个新型癌基因，它在体内外均增强了肿瘤细胞的增殖和锚定非依赖性生长能力。此外，我们发现TRIM65主要通过直接与BTG3（BTG抗增殖因子3）相互作用来调节RCC增殖，进而诱导K48连接的泛素化并通过K41氨基酸进行后续降解。此外，TRIM65通过降解BTG3缓解了G2/M期细胞周期阻滞，并调节下游因子。进一步的研究揭示，TRIM65通过TRIM65-BTG3-CyclinD1轴起作用，临床样本IHC芯片数据显示TRIM65与BTG3之间存在负相关。总之，我们的研究结果表明，TRIM65通过降解BTG3调节细胞周期促进RCC细胞增殖，提示TRIM65可能是RCC治疗的一个有前景的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRIM65在肾细胞癌中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- TRIM65通过其SPRY结构域直接结合BTG3（110-162aa），促进BTG3在K41位点的K48连接泛素化并降解，从而解除G2/M期细胞周期阻滞，上调CyclinD1，促进RCC增殖。
- 主要证据
- 体外细胞增殖和软琼脂实验、异种移植瘤模型、Co-IP和GST pull-down、泛素化分析以及临床IHC芯片数据均支持该机制。
- 研究意义
- TRIM65-BTG3-CyclinD1轴可能成为RCC治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能实验（敲低和过表达TRIM65）
验证TRIM65对RCC细胞增殖和锚定非依赖性生长的影响
使用shRNA敲低769-P和Caki-2中TRIM65，或在ACHN和Caki-1中过表达TRIM65；检测细胞增殖（CCK8）、集落形成和软琼脂克隆形成能力。
体内异种移植瘤实验
验证TRIM65对肿瘤生长的影响
将稳定敲低TRIM65的769-P细胞或过表达TRIM65的ACHN细胞皮下注射到裸鼠，定期测量肿瘤体积和重量，并通过IHC检测Ki67和PCNA表达。
筛选TRIM65相互作用蛋白
寻找TRIM65的直接结合伙伴，揭示其分子机制
通过酵母双杂交筛选，以全长人TRIM65为诱饵，确定BTG3为候选蛋白，并通过Co-IP和GST pull-down验证。
泛素化及降解机制分析
验证TRIM65是否通过泛素-蛋白酶体途径降解BTG3并确定泛素化位点
检测TRIM65对BTG3蛋白水平的影响（剂量依赖、半衰期），利用泛素突变体确定连接类型，并通过位点突变确定关键赖氨酸残基。
细胞周期分析
探究TRIM65是否通过BTG3影响细胞周期进程
使用流式细胞术检测TRIM65敲低或过表达对细胞周期分布的影响，并检测BTG3和CyclinD1的表达。
拯救实验
验证TRIM65促增殖作用是否依赖于BTG3的降解
在TRIM65过表达的ACHN细胞中共转染BTG3或BTG3 K41R，检测增殖、集落形成、软琼脂和细胞周期变化。
临床样本相关性分析
验证TRIM65与BTG3在临床样本中的表达相关性
通过IHC检测ccRCC组织芯片中TRIM65和BTG3的表达，并分析相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Procell | -- |
| MEM培养基 | Procell | -- | |
| DMEM培养基 | Procell | -- | |
| McCoy's 5A培养基 | Procell | -- | |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | MG132 | Sigma-Aldrich | -- |
| Fascaplysin | GlpBio | -- | |
| Western blotting | TRIM65抗体 | Sigma-Aldrich | HPA021578 |
| BTG3抗体 | OriGene | TA323849 | |
| K63连接特异性泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 5621S | |
| K48连接特异性泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 8081S | |
| 泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3936S | |
| GFP抗体 | Proteintech | 66002-1-Ig | |
| FLAG抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| FLAG抗体 | Proteintech | 20543-1-Ig | |
| HA抗体 | Proteintech | 66006-2-Ig | |
| HA抗体 | Proteintech | 51064-2-Ig | |
| Myc抗体 | Proteintech | 60003-2-Ig | |
| CyclinD1抗体 | Proteintech | 60186-1-Ig | |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Proteintech | 27309-1-AP |
| Western blotting | PCNA抗体 | Proteintech | 10205-2-AP |
| 免疫荧光 | Calnexin抗体 | Proteintech | 66903-1-Ig |
| GolGA2/GM130抗体 | Proteintech | 66662-1-Ig | |
| CD107b/LAMP2抗体 | Proteintech | 66301-1-Ig | |
| EEA1抗体 | Proteintech | 68065-1-Ig | |
| Western blotting | GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| RT-qPCR | Q-PCR引物 | TSINGKE Biological Technology | -- |
| 基因敲低 | BTG3 siRNA | OBIO | -- |
| 构建载体 | BLOCK-iT Pol II miR-RNAi表达试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 慢病毒包装 | pMD2G包装质粒 | -- | -- |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞增殖 | CCK8试剂盒 | Dojindo | -- |
| Western blotting | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| RT-qPCR | ViiA-7实时荧光定量PCR仪 | ABI | -- |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Roche | -- |
| GST pull-down | 谷胱甘肽琼脂糖4B珠 | GE Healthcare | -- |
| 免疫荧光 | LSM800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 免疫组化 | 组织芯片 | Shanghai Outdo Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源及培养条件，STR认证、支原体检测；培养基、FBS浓度、抗生素浓度 阅读提示：Materials and methods: Cell lines |
| 基因敲低/过表达 | shRNA序列、慢病毒包装方法（pMD2G、psPAX2）、感染复数（MOI未明确）、polybrene浓度、嘌呤霉素筛选浓度及时间 阅读提示：Materials and methods: Vectors and lentivirus infection |
| 细胞增殖检测 | CCK8检测细胞密度、孵育时间；低血清实验的血清浓度和检测时间点；集落形成实验细胞数、培养天数、结晶紫浓度；软琼脂实验细胞数、琼脂浓度、培养天数、克隆大小阈值 阅读提示：Materials and methods: Cell proliferation assay; Colony formation and soft agar assay |
| 体内实验 | 细胞注射数量、注射体积、小鼠周龄性别、肿瘤测量频率、肿瘤体积计算公式、实验终点时间（15天或30天） 阅读提示：Materials and methods: Tumor xenografts; Figure legends 2 |
| 蛋白相互作用与泛素化 | Co-IP抗体、裂解液成分、孵育时间；GST pull-down中重组蛋白浓度；泛素化实验中的质粒组合、免疫沉淀抗体 阅读提示：Materials and methods: Co-immunoprecipitation; GST pull-down; Figure legends 3 and 4 |
| 细胞周期分析 | PI染色方法、流式细胞术参数、统计分析重复次数 阅读提示：Figure legend 5; Materials and methods: Statistical analysis |