生信分析筛选并验证NREP表达与预后
筛选在乳腺癌中高表达且与预后相关的基因，并验证NREP的临床相关性。
利用9个GEO数据库进行差异表达基因分析，通过Venn图、热图、GO/KEGG富集分析筛选候选基因，并在临床样本中通过IHC验证NREP表达，分析其与生存预后的关系。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
NREP，受HIF-1α转录上调，通过促进糖酵解加剧乳腺癌细胞生长和转移
NREP, transcriptionally upregulated by HIF-1α, aggravates breast cancer cell growth and metastasis by promoting glycolysis.
实验完整度
高包含临床样本IHC、细胞功能实验、双荧光素酶和ChIP、体内移植瘤和转移模型、RNA-seq等多层级验证，且进行了功能回补实验。
主要模型
MDA-MB-468和MDA-MB-231乳腺癌细胞系（体外） HUVEC细胞（血管生成） BALB/c裸鼠移植瘤模型（体内）
重点核对
细胞系：MDA-MB-468、MDA-MB-231，培养条件：L15培养基+10%FBS，37°C，5%CO2 低氧处理：1% O2，24小时 NREP敲低：shRNA（shNREP-1、shNREP-2）和过表达（pLVX-IRES-puro） 动物模型：4周龄雌性BALB/c裸鼠，皮下注射5×10^6细胞，尾静脉注射2.5×10^6细胞 实验重复和统计：数据以mean±SD表示，采用t检验或ANOVA，p<0.05
摘要
乳腺癌（BC）对女性健康构成巨大威胁。神经元再生相关蛋白（NREP）是一种多功能蛋白，参与胚胎发育、再生和人类疾病。然而，NREP在肿瘤中的生物学功能鲜有报道，其在BC中的作用仍不清楚。生物信息学分析显示，NREP在BC患者中高表达，并与不良生存密切相关。在低氧条件下，BC细胞中NREP上调，而这种促进作用可被低氧诱导因子HIF-1α的抑制所逆转。荧光素酶报告系统和染色质免疫沉淀实验证实，HIF-1α直接结合NREP启动子以增加NREP的转录活性。抑制NREP可抑制BC细胞增殖，阻滞细胞周期于G1/S期，并促进凋亡和caspase-3活性。抑制NREP降低了HUVEC的管形成能力。此外，NREP下调对BC细胞的迁移、侵袭和EMT具有抑制作用。在NREP过表达的细胞中，所有这些变化均被逆转。在体内，动物实验也证实NREP促进BC肿瘤的生长和转移。此外，NREP促进细胞糖酵解，并在NREP过表达的BC细胞中提高葡萄糖消耗、ATP、乳酸产生和葡萄糖转运蛋白表达的水平。总之，我们的结果表明，NREP可被HIF-1α转录激活，其可能通过促进细胞糖酵解加剧BC肿瘤的生长和转移。该结果表明NREP可能在BC进展中发挥重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NREP在乳腺癌中的生物学功能及其上游调控机制和潜在下游机制是什么？
- 核心机制
- HIF-1α直接结合NREP启动子并转录激活NREP，NREP通过促进细胞糖酵解（增加葡萄糖消耗、ATP和乳酸产生）及上调GLUT1、HK2、PKM2、LDHA等糖酵解相关蛋白，进而促进乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和转移。
- 主要证据
- 基于9个GEO数据库分析NREP高表达与不良预后相关；临床样本IHC验证；细胞实验（MTT、流式、Transwell、管形成）证实NREP促进增殖和转移；双荧光素酶和ChIP证实HIF-1α结合NREP启动子；体内移植瘤和肺转移模型验证；RNA-seq显示NREP影响细胞周期和糖酵解通路。
- 研究意义
- 作者提出NREP在乳腺癌进展中发挥重要作用，可能作为乳腺癌治疗和预后的潜在靶点或标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HIF-1α对NREP的转录调控
验证HIF-1α是否直接结合NREP启动子并调控其转录。
在MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞中，通过qPCR和Western blot检测低氧和HIF-1α抑制后NREP的表达；使用双荧光素酶报告基因和ChIP实验确定HIF-1α与NREP启动子的直接结合。
体外功能实验检测NREP对细胞增殖和血管生成的影响
探究NREP对乳腺癌细胞增殖、凋亡、细胞周期和血管生成的影响。
在MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞中敲低或过表达NREP，通过MTT、流式细胞术、克隆形成、EdU、caspase-3活性检测细胞增殖和凋亡；通过HUVEC管形成实验检测血管生成。
体外功能实验检测NREP对迁移、侵袭和EMT的影响
评估NREP对乳腺癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化的影响。
通过Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力，观察细胞形态变化，用Western blot和qPCR检测EMT标志物（E-cadherin、N-cadherin、SLUG、MMP9）的表达。
体内实验验证NREP对肿瘤生长和转移的影响
验证NREP在体内对乳腺癌肿瘤生长和肺转移的影响。
将NREP敲低或过表达的MDA-MB-468细胞皮下注射或尾静脉注射至裸鼠，监测肿瘤体积，肺转移结节计数，H&E染色，IHC检测Ki67、CD31、TUNEL等。
检测NREP对细胞糖酵解的影响
探究NREP是否通过促进糖酵解影响乳腺癌细胞代谢。
在NREP敲低或过表达的两种细胞中，检测葡萄糖消耗、ATP水平、乳酸产生，并用Western blot检测糖酵解相关蛋白（GLUT1、HK2、PKM2、LDHA）的表达。
RNA-seq分析NREP下游通路
通过转录组分析寻找NREP调控的下游基因和信号通路。
对NREP敲低的MDA-MB-468细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因，进行GO/KEGG富集分析，并验证关键基因（CCNA2、CCNE1、LDHA、GLUT1、PKM2）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | Procell | PM150710 |
| MEM培养基 | Solarbio | 41500 | |
| L15培养基 | Procell | PM151011 | |
| 胎牛血清 | Tianhang Biotech | 11011-8611 | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lip3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| qPCR | TRIpure试剂 | BioTeke | RP1001 |
| RNA酶抑制剂 | BioTeke | RP5602 | |
| BeyoRT II M-MLV逆转录酶 | Beyotime | D7160L | |
| 2×Taq PCR预混液 | Solarbio | PC1150 | |
| SYBR Green染料 | Solarbio | SY1020 | |
| PCR仪（ExicyclerTM96） | BIONEER | -- | |
| Western blot | 裂解液 | Beyotime | P0013 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 脱脂牛奶 | YiLi | -- | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Beyotime | A0208 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | Beyotime | A0216 | |
| ECL底物 | Beyotime | P0018 | |
| 抗NREP抗体 | Thermofisher | PA5-68426 | |
| 抗HIF-1α抗体 | Affinity | AF1009 | |
| 抗E-cadherin抗体 | Abclonal | A20798 | |
| 抗N-cadherin抗体 | Abclonal | A19083 | |
| 抗SLUG抗体 | Abclonal | A1057 | |
| 抗MMP9抗体 | Abclonal | A0289 | |
| 抗PKM2抗体 | Abclonal | A13905 | |
| 抗GLUT1抗体 | Affinity | AF5462 | |
| 抗HK2抗体 | Abclonal | A20829 | |
| 抗LDHA抗体 | Abclonal | A1146 | |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | KeyGEN BioTech | KGAF040 |
| pGL3-Basic载体 | Fenghui Bio | BR014 | |
| pRL-TK内参质粒 | -- | -- | |
| HIF-1α siRNA | General Biosystems | -- | |
| 多功能酶标仪（M200Pro） | TECAN | -- | |
| ChIP实验 | ChIP检测试剂盒 | Wanlei Bio | WLA106a |
| 抗HIF-1α抗体 | Proteintech | 20960-1-AP | |
| 抗IgG抗体 | -- | -- | |
| 抗RNA聚合酶II抗体 | -- | -- | |
| DNA凝胶回收试剂盒 | Wanlei Bio | -- | |
| MTT实验 | MTT检测试剂盒 | Beyotime | C0009 |
| 酶标仪（800TS） | BIOTEK | -- | |
| 细胞周期检测 | 细胞周期检测试剂盒 | KeyGEN BioTech | KGA9101 |
| 流式细胞仪（NovoCyte） | Agilent | -- | |
| 克隆形成实验 | Weigert-Giemsa染液 | KeyGen Biotech | KGA227 |
| EdU染色 | EdU成像检测试剂盒 | KeyGen Biotech | KGA331 |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 荧光显微镜（IX53） | OLYMPUS | -- | |
| 管形成实验 | HUVEC专用培养基（PriMed-iCell-002） | iCell | -- |
| 基质胶 | Corning | 356234 | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒 | KeyGEN BioTech | KGA1102 |
| 动物实验 | BALB/c小鼠 | Cavens | -- |
| IHC实验 | 3%过氧化氢 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218 |
| 牛血清白蛋白 | Sangon Biotech | A602440-0050 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | ThermoFisher | #31460 | |
| DAB显色液 | Maixin-Bio | DAB-1031 | |
| 苏木素 | Solarbio | H8070 | |
| 抗NREP抗体 | Affinity | DF14359 | |
| 抗Ki67抗体 | Affinity | AF0198 | |
| 抗CD31抗体 | Abclonal | A4900 | |
| 显微镜（BX53） | OLYMPUS | -- | |
| TUNEL染色 | 原位细胞死亡检测试剂盒 | Roche | 12156792910 |
| Triton X-100 | Beyotime | ST795 | |
| DAPI | Aladdin | D106471-5mg | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | LABSELECT | 14341 |
| 基质胶 | Corning | 356234 | |
| 结晶紫染液 | Amresco | 0528 | |
| H&E染色 | 苏木素 | Solarbio | H8070 |
| 伊红染液 | Sangon Biotech | A600190 | |
| 乙醇 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| 检测试剂盒 | Caspase 3活性检测试剂盒 | Beyotime | C1116 |
| 葡萄糖消耗检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | F006 | |
| ATP水平检测试剂盒 | Beyotime | S0026 | |
| 乳酸产生检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A019 | |
| Bradford蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0006 | |
| 酶标仪（ELX-800） | BIOTEK | -- | |
| RNA-seq | 片段分析仪5400 | Agilent Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与低氧处理 | 细胞系来源（iCell）；培养基种类及血清浓度；低氧条件（1% O2，24h）；细胞代数 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and treatment |
| NREP敲低/过表达 | shRNA序列（shNREP-1、shNREP-2）；载体（pLVX-shRNA1和pLVX-IRES-puro）；转染试剂（Lip3000）；嘌呤霉素筛选浓度 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and treatment |
| 双荧光素酶报告实验 | 报告载体构建（NREP启动子片段）；共转染质粒比例；检测时间（转染后24h和低氧处理24h） 阅读提示：Materials and methods, Luciferase reporter assay; Figure 2G-H |
| ChIP实验 | 抗体（anti-HIF-1α）；DNA片段化条件（超声12组，10s，间隔30s）；引物序列（site2和site4） 阅读提示：Materials and methods, Chromatin immunoprecipitation (ChIP); Figure 2I-J |
| 体内动物实验 | 小鼠品系、年龄和性别（4周龄雌性BALB/c裸鼠）；每组数量（6只）；细胞注射数量（皮下5×10^6，尾静脉2.5×10^6）；观察时间（皮下24天，尾静脉9周） 阅读提示：Materials and methods, Animal experiments; Figure 4I-K和5A-G |