临床关联分析
评估TSPAN4表达与GBM预后及临床病理特征的关系
利用TCGA、CGGA、GSE16011数据库进行表达和生存分析，并在GBM组织芯片上进行IHC染色验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
TSPAN4通过调控EGFR稳定性影响胶质母细胞瘤的进展
TSPAN4 influences glioblastoma progression through regulating EGFR stability.
实验完整度
高结合TCGA等数据库分析、GBM组织芯片验证、体外细胞功能实验、体内颅内异种移植模型及机制研究（Co-IP、质谱、CHX实验）等多层级验证。
主要模型
U87和U251胶质母细胞瘤细胞系 原代人GBM细胞（GBM1） U87-luciferase颅内异种移植裸鼠模型
重点核对
TSPAN4表达与GBM预后及临床病理参数相关性（TCGA等数据库） TSPAN4敲低抑制GBM细胞增殖、侵袭及体内肿瘤生长 TSPAN4与EGFR相互作用及共定位（Co-IP、免疫荧光） TSPAN4调控EGFR蛋白稳定性（CHX、MG132、Baf处理） EGFR过表达或抑制剂对TSPAN4敲低效应的逆转
摘要
胶质母细胞瘤（GBM）以高发病率、高死亡率和低治愈率为特征。近期研究表明，TSPAN4被认为是迁移体（一种与细胞迁移相关的囊泡细胞器）的标志蛋白。然而，TSPAN4在癌症中的内在作用尚未阐明，尤其是在GBM中。在此，我们报道TSPAN4通过与表皮生长因子受体（EGFR）相互作用并调控其稳定性来促进GBM进展。临床上，TSPAN4在GBM中高表达，并与不良预后显著相关。功能上，TSPAN4敲低在体外显著抑制GBM细胞增殖和侵袭，在体内抑制致瘤性。相反，TSPAN4过表达促进GBM进展。机制上，TSPAN4敲低破坏与EGFR的相互作用，使其表达不稳定并使EGFR及下游信号通路（如MEK/ERK、STAT3和AKT）失活。我们的研究揭示TSPAN4通过调控EGFR稳定性驱动GBM进展，并可能成为癌症治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TSPAN4在GBM中的内在作用及其促进肿瘤进展的机制是什么？
- 核心机制
- TSPAN4与EGFR相互作用并增强其蛋白稳定性，通过蛋白酶体途径抑制EGFR降解，激活MEK/ERK、STAT3和AKT等下游信号通路，进而促进GBM进展。
- 主要证据
- 通过Co-IP和质谱鉴定TSPAN4相互作用蛋白，免疫荧光验证共定位；CHX、MG132和Baf处理证明TSPAN4维持EGFR稳定性；细胞功能实验（CCK-8、克隆形成、Transwell）和体内颅内异种移植模型证实TSPAN4促进GBM生长。
- 研究意义
- 本研究揭示TSPAN4-EGFR调控轴在GBM发展中的关键作用，为克服EGFR耐药提供新的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能实验
验证TSPAN4对GBM细胞增殖、侵袭、周期和凋亡的影响
通过shRNA敲低和过表达TSPAN4，进行CCK-8、克隆形成、Transwell、EdU/Ki67染色、流式细胞术检测。
体内致瘤性实验
验证TSPAN4对GBM体内肿瘤生长的影响
建立U87-luciferase颅内异种移植模型，通过生物发光成像监测肿瘤生长，并检测Ki67和active caspase-3表达。
转录组和蛋白质组分析
探索TSPAN4敲低后GBM细胞的分子变化
对shCtrl和shTSPAN4的U87细胞进行RNA-seq和蛋白质组学分析，鉴定差异表达基因和蛋白并进行通路富集分析。
相互作用验证
验证TSPAN4与EGFR的相互作用及关键结构域
通过外源性和内源性Co-IP、免疫荧光验证相互作用，利用HDOCK预测和截短突变体实验确定结合区域。
机制探究
阐明TSPAN4调控EGFR稳定性的机制
检测TSPAN4敲低或过表达后EGFR及其下游信号蛋白的表达，并通过CHX、MG132和Baf处理分析EGFR降解途径。
功能回补实验
验证TSPAN4的作用是否依赖于EGFR
在TSPAN4敲低细胞中过表达EGFR或使用EGFR抑制剂（Gefitinib），检测细胞增殖和侵袭变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 抗TSPAN4抗体 | Novus | NBP1-59438 |
| 抗FLAG抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗HA抗体 | Sigma | H9658 | |
| 抗FLAG抗体 | CST | 14793 | |
| 抗HA抗体 | CST | 3724 | |
| 抗GAPDH抗体 | CST | 5174 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | CST | 2128 | |
| 抗CDK1抗体 | Abcam | ab133327 | |
| 抗CDK2抗体 | Abcam | ab32147 | |
| 抗CCNB1抗体 | Abcam | ab32053 | |
| 抗活性Caspase-3抗体 | CST | 9661 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 抗EGFR抗体 | Abcam | ab52894 | |
| 抗EGFR抗体 | Abcam | ab30 | |
| 抗EGFR抗体 | Proteintech | 66455-1-Ig | |
| 抗磷酸化EGFR抗体 | CST | 3777 | |
| 抗MEK1/2抗体 | CST | 9126 | |
| 抗磷酸化MEK1/2抗体 | CST | 9154 | |
| 抗ERK1/2抗体 | CST | 4695 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | CST | 4370 | |
| 抗AKT抗体 | CST | 4685 | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | CST | 4060 | |
| 抗STAT3抗体 | CST | 12640 | |
| 抗磷酸化STAT3抗体 | CST | 9145 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L)二抗，HRP | Thermo Fisher Scientific | 31430 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L)二抗，HRP | Thermo Fisher Scientific | 31460 | |
| 驴抗兔Alexa Fluor 488二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| 驴抗兔Alexa Fluor 594二抗 | Thermo Fisher Scientific | SA5-10040 | |
| 细菌培养 | TOP10感受态细胞 | Tsingke | TSC-C12 |
| 组织芯片 | GBM组织芯片 | Wuhan Servicebio | IWLT-C-70GL61 |
| 蛋白质提取 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 |
| 药物处理 | MG132 | Sigma | 474790 |
| 巴佛洛霉素A1 | Sigma | 196000 | |
| EGFR抑制剂（吉非替尼） | Selleck | S1025 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| 侵袭实验 | 基质胶 | BD | 356234 |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 1668019 |
| 细胞培养 | 重组人EGF蛋白 | R&D | 236-EG |
| 体内成像 | 荧光素 | Promega | P1041 |
| 免疫沉淀 | Protein A/G磁珠 | Pierce | 88803 |
| 细胞培养 | 多聚赖氨酸 | Sigma | P6407 |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶（PI）染色液 | BD | 556463 |
| 克隆形成 | 结晶紫染色液 | Beyotime | C0121 |
| 免疫荧光 | Hoechst33342染色液 | NOVON | MC160 |
| 细胞增殖检测 | EdU细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime | C0071S |
| CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0040 | |
| 细胞周期检测 | 细胞周期和凋亡分析试剂盒 | Beyotime | C1052 |
| RT-qPCR | SYBR Green预混液 | Yeasen | 11203ES08 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 原代人GBM细胞（GBM1） | Procell | CP-H148 | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Beijing Vital River Laboratory | -- |
| 成像 | 激光扫描共聚焦显微镜 | Olympus | FV-1000 |
| 体内成像 | IVIS小动物活体成像系统 | PerkinElmer | IVIS® Lumina III |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | U87、U251和HEK293T细胞使用DMEM培养基，添加10% FBS和1%青霉素-链霉素，在37°C、5% CO2条件下培养。GBM1原代细胞在层粘连蛋白上无血清培养。 阅读提示：STAR★Methods 细胞培养部分 |
| TSPAN4敲低和过表达 | 使用两个独立shRNA序列（shTSPAN4-1#和shTSPAN4-2#）建立敲低稳定细胞系；过表达使用TSPAN4-FLAG质粒。 阅读提示：Results 图2和图3图注，以及STAR★Methods 质粒构建和慢病毒感染部分 |
| 细胞增殖和侵袭实验 | CCK-8实验检测450nm吸光度；克隆形成实验接种1000个细胞培养14天；Transwell实验使用5×10^4个细胞，8 μm孔径，基质胶包被，24小时。 阅读提示：STAR★Methods 细胞增殖、侵袭和细胞周期实验部分 |
| 体内异种移植实验 | 6周龄雄性BALB/c裸鼠，颅内注射1×10^6个U87-luciferase细胞，利用生物发光成像监测肿瘤生长。 阅读提示：STAR★Methods 异种移植实验部分 |
| 蛋白稳定性分析 | CHX实验（0,4,8,12,24小时）检测EGFR半衰期；MG132（蛋白酶体抑制剂）和Baf（溶酶体抑制剂）处理检测EGFR表达变化。 阅读提示：Results 图7H和7I图注，以及STAR★Methods 免疫印迹和免疫沉淀部分 |