IGSF9及突变体构建与细胞系建立
在肺癌细胞系中过表达IGSF9全长、胞外域（ECD）和胞内域（ID）嵌合体，以研究各结构域在侵袭转移中的作用。
利用慢病毒载体在H1299和H1975细胞中稳定表达IGSF9、IGSF9-ECD和LILRB4-ECD-IGSF9-ID，经流式分选获得双阳性细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
IGSF9通过GSK-3β/β-catenin介导的EMT促进肺癌侵袭和转移
IGSF9 promotes tumor invasion and metastasis through GSK-3β/β-catenin mediated EMT in lung cancer.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、免疫共沉淀、Western blot、免疫荧光、体内尾静脉转移模型及抗体阻断治疗，功能验证和机制验证充分。
主要模型
非小细胞肺癌细胞系H1299和H1975 小鼠LL/2细胞 NSG小鼠尾静脉转移模型 C57BL/6-Igsf9-/-小鼠模型
重点核对
IGSF9全长、ECD和ID（LILRB4-ECD-IGSF9-ID嵌合体）在H1299和H1975细胞中的过表达 细胞形态变化（扁平多边形变为细长条状）作为EMT的初步指标 EMT标志物表达变化：E-cadherin下调，ZEB1、N-cadherin、Vimentin上调 β-catenin核转位及细胞质/核分离验证 GSK-3β抑制剂CHIR-98014处理对IGSF9介导的EMT的逆转效果
摘要
我们之前报道过免疫球蛋白超家族成员9（IGSF9）作为肿瘤特异性免疫检查点促进肿瘤免疫逃逸，然而，作为一种粘附分子，IGSF9是否促进肿瘤侵袭和转移尚未被报道。在这里，IGSF9的全长和胞内域（ID）而非胞外域（ECD）能改变肿瘤细胞形态，从扁平多边形变为细长条状，表明IGSF9信号通路具有介导上皮-间质转化（EMT）的潜力。实时PCR和蛋白质印迹也显示，在IGSF9和IGSF9-ID组中，间质标志物显著上调，上皮标志物显著下调。同时，免疫荧光显示，在IGSF9和IGSF9-ID组中，β-catenin明显转位到细胞核。体外和体内数据表明，IGSF9、IGSF9-ID和ECD能促进肿瘤侵袭和转移。机制上，IGSF9-ID能招募GSK-3β，导致β-catenin积累和核转位，从而触发EMT。抗IGSF9能显著抑制侵袭和转移，IGSF9是肺癌治疗的有效候选靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IGSF9是否作为粘附分子促进肺癌的侵袭和转移，其潜在机制是什么？
- 核心机制
- IGSF9的胞内域招募GSK-3β，使其从降解复合物中分离，导致β-catenin磷酸化减少、积累并转位进入细胞核，激活Wnt/β-catenin信号通路，进而触发EMT。
- 主要证据
- 体外实验（transwell迁移/侵袭、伤口愈合）和体内实验（NSG小鼠尾静脉转移模型）显示IGSF9、IGSF9-ECD和IGSF9-ID促进侵袭转移；免疫共沉淀证实IGSF9与GSK-3β相互作用；Western blot和免疫荧光证明β-catenin核转位及EMT标志物变化；GSK-3β抑制剂CHIR-98014救援实验验证了信号轴。
- 研究意义
- IGSF9是肺癌治疗的有效候选靶点，抗IGSF9治疗可显著抑制肿瘤侵袭和转移。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外侵袭和迁移能力检测
评估IGSF9及其结构域对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。
采用transwell迁移和侵袭实验（使用基质胶涂层）及伤口愈合实验检测细胞迁移和侵袭能力。
EMT标志物检测
验证IGSF9是否诱导EMT及其结构域依赖性。
通过实时PCR和Western blot检测间质标志物（ZEB1、N-cadherin、Vimentin）和上皮标志物（E-cadherin、ZO-1）的表达变化；免疫荧光观察β-catenin和E-cadherin的定位。
Wnt/β-catenin信号通路验证
探究IGSF9胞内域是否通过招募GSK-3β激活Wnt/β-catenin信号通路。
进行免疫共沉淀检测IGSF9与GSK-3β的相互作用；分离细胞质和核蛋白检测β-catenin分布；使用GSK-3β抑制剂CHIR-98014处理细胞，检测信号通路分子变化。
体内转移实验（NSG小鼠模型）
在体内验证IGSF9及其结构域对肿瘤侵袭和转移的促进作用。
将H1299-control、-IGSF9、-IGSF9-ECD和-LILRB4-ECD-IGSF9-ID细胞经尾静脉注射NSG小鼠，通过生物发光成像监测肿瘤进展，并在实验终点检测肺和肝中的GFP+细胞及HE染色。
抗IGSF9治疗实验
评估抗IGSF9抗体对肿瘤侵袭和转移的抑制作用。
在NSG小鼠模型中，从第二天开始每隔3天注射抗IGSF9或同型对照，监测肿瘤进展，并在终点分析GFP+细胞和肿瘤数量。在C57BL/6-Igsf9-/-小鼠模型中重复类似实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 流式分选与检测 | BD FACSAria III流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 流式检测 | LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| C6 Plus流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 伤口愈合实验 | Zeiss Axio Vert.A1倒置显微镜 | Zeiss | -- |
| 图像分析 | ZEISS ZEN 3.7软件 | Zeiss | -- |
| Transwell迁移/侵袭实验 | Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 结晶紫 | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| 实时PCR | RNAiso Plus试剂 | TaKaRa | 9108 |
| Primescript™ RT预混液 | TaKaRa | RR036A | |
| TB Green Premix Ex Taq™ | TaKaRa | RR420A | |
| Western blotting | RIPA裂解缓冲液 | Solarbio | R0020 |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime Biotechnology | P1081 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0012 | |
| NE-PER核和细胞质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78835 | |
| 免疫共沉淀 | IP裂解缓冲液 | Solarbio | R0020 |
| 蛋白A/G磁珠 | MCE | -- | |
| 免疫荧光 | 细胞培养处理盖玻片 | Solarbio | YA0350 |
| DAPI | -- | -- | |
| Zeiss LSM880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 体内成像 | 动物光谱成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| 同型对照抗体 | InVivoMab | 847422A1 | |
| 抗IGSF9抗体 | -- | -- | |
| 药物处理（机制验证） | CHIR-98014 | -- | -- |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 流式染色 | APC偶联链霉亲和素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（H1299、H1975、A549、H460、LL/2、HEK293T）及培养条件（培养基、血清浓度、青霉素/链霉素浓度） 阅读提示：Materials and methods - Cell culture |
| 质粒构建与稳定转染 | IGSF9全长、ECD、LILRB4-ECD-IGSF9-ID的载体构建及慢病毒包装，嘌呤霉素筛选浓度（1μg/ml），流式分选标记 阅读提示：Materials and methods - Plasmids and transfection |
| 体外迁移和侵袭实验 | Transwell小室规格（8μm孔径）、细胞数量（1×10^5）、血清浓度（上室3% FBS，下室10% FBS）、迁移时间（8-12h）、结晶紫染色浓度和时间 阅读提示：Materials and methods - Transwell migrations and invasion assays |
| EMT标志物检测 | 实时PCR引物序列（表S2）、Western blot抗体（表S1）、免疫荧光固定和通透条件（4% PFA 15min，0.3% Triton X-100 10min） 阅读提示：Materials and methods - Real-time PCR, Western blotting, Immunofluorescence |
| 免疫共沉淀 | 裂解缓冲液、抗体用量（5-10 μg）、磁珠类型（protein A/G）及洗涤条件（PBST含0.5% Tween-20） 阅读提示：Materials and methods - Immunoprecipitation |
| 体内转移模型 | 细胞数量（1×10^6）、注射体积（200μl PBS）、小鼠品系（NSG或C57BL/6-Igsf9-/-）、成像时间点、抗IGSF9剂量（200μg/小鼠）及给药频率（每3天） 阅读提示：Materials and methods - IGSF9 promoted invasion and metastasis in H1299 NSG mouse model, Anti-IGSF9 was used to treat mouse models |