建立自然衰老小鼠肌肉减少症模型
验证小鼠模型是否成功模拟肌肉减少症，并检测炎症状态
使用不同年龄（20、60、88周龄）的C57/BL6J小鼠，通过抓力、肌肉重量、组织学染色和电镜评估肌肉减少症表型，并检测血清和肌肉中TNF-α水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
TNF-α通过caspase-8/caspase-3/GSDME介导的焦亡促进肌肉减少症
TNF-α contributes to sarcopenia through caspase-8/caspase-3/GSDME-mediated pyroptosis.
实验完整度
高包含自然衰老小鼠模型、TNF-α刺激的C2C12肌管体外模型，并通过抑制剂和GSDME敲低进行功能验证和机制研究。
主要模型
自然衰老小鼠（C57/BL6J） C2C12肌管 C2C12肌母细胞
重点核对
小鼠年龄分组：年轻（20周龄）、中年（60周龄）、老年（88周龄） TNF-α处理浓度：0、1、10、100 ng/ml TNF-α处理时间：0、6、12、24、48、72小时 caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK（50 μM）和caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK（50 μM） RIPK3抑制剂GSK'872（1 μM）
摘要
肌肉减少症已成为老年人残疾和死亡的主要原因。据报道，程序性细胞死亡（PCD）与肌肉减少症的发展有关，其特点是肌纤维大小和数量减少。TNF-α也被证实通过其复杂的信号通路（包括细胞死亡信号）在肌肉减少症中发挥重要作用。然而，目前尚不清楚TNF-α是否通过介导焦亡（PCD的一种类型）来促进肌肉减少症。在此，我们首先建立了自然衰老的肌肉减少症小鼠模型，并证实了衰老小鼠中存在以TNF-α为代表的炎症状态。在患有肌肉减少症的衰老小鼠的骨骼肌细胞中也发现了GSDME介导的焦亡和凋亡性caspase-8/-3活化的证据。我们通过使用caspase-8和caspase-3抑制剂证明，TNF-α通过激活caspase-8和caspase-3触发肌管中GSDME介导的焦亡。通过比较TNF复合物IIa和TNF复合物IIb对caspase-8活化和GSDME表达的作用，发现TNF-α更倾向于组装TNF复合物IIb来激活caspase-8并触发焦亡。此外，通过敲低GSDME，验证了焦亡的肌管导致MHC1表达降低并最终导致肌管丢失。我们的工作揭示了一种新的机制，即TNF-α/caspase-8/caspase-3/GSDME信号介导的焦亡促进肌肉减少症的发展。caspase-3/GSDME信号介导的焦亡可能成为肌肉减少症一个有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TNF-α是否通过介导焦亡（一种程序性细胞死亡）促进肌肉减少症的发生？
- 核心机制
- TNF-α通过组装TNF复合物IIb激活caspase-8和caspase-3，进而裂解GSDME释放N端结构域，在肌细胞膜上形成孔道，执行焦亡，导致肌纤维丢失和肌肉减少症。
- 主要证据
- 自然衰老小鼠肌肉中检测到GSDME-N、cleaved-caspase-8和cleaved-caspase-3表达升高；TNF-α处理的C2C12肌管中，使用caspase-8抑制剂和caspase-3抑制剂或敲低GSDME可抑制焦亡和MHC1表达下降。
- 研究意义
- 揭示焦亡在肌肉减少症发病中的新机制，caspase-3/GSDME信号介导的焦亡可能成为肌肉减少症的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测衰老肌肉中的焦亡和caspase活化
验证衰老肌肉中是否发生GSDME介导的焦亡及caspase-8/3活化
通过Western blot检测GSDMD、GSDME及其N端片段，以及caspase-8、caspase-3的活化形式，并通过TUNEL染色、免疫荧光和免疫组化进一步验证。
TNF-α诱导C2C12肌管焦亡
验证TNF-α能否诱导肌管发生GSDME介导的焦亡
用不同浓度（0-100 ng/ml）和不同时间（0-72小时）的TNF-α处理C2C12肌管，检测GSDME裂解、细胞形态、LDH释放和PI染色。
验证caspase-8和caspase-3在TNF-α诱导焦亡中的作用
确定caspase-8和caspase-3是否为TNF-α诱导焦亡所必需
使用caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK（联合RIPK3抑制剂GSK'872）和caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK预处理肌管，再以TNF-α处理，检测GSDME裂解、LDH释放和PI染色。
比较TNF复合物IIa和IIb在激活caspase-8中的作用
明确TNF-α主要通过哪种复合物激活caspase-8并诱导焦亡
分别用TNF-α+CHX（诱导复合物IIa）和TNF-α+TAK1i（诱导复合物IIb）处理肌管，比较不同时间点caspase-8活化和GSDME-N表达。
验证焦亡在TNF-α诱导的肌管丢失和MHC1表达下降中的作用
证明GSDME介导的焦亡是否导致肌管丢失和MHC1表达下降
检测TNF-α处理或TNF-α+TAK1i处理下MHC1表达变化，并使用caspase抑制剂或敲低GSDME（LV-shGSDME）逆转MHC1下降。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗GSDMD抗体 | Abcam | ab219800 |
| 抗GSDME抗体 | Abcam | ab215191 | |
| 抗caspase-8抗体 | Proteintech | 66093-1-Ig | |
| 抗caspase-3抗体 | Proteintech | 19677-1-AP | |
| 抗TNF-α抗体 | Proteintech | 60291-1-Ig | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 66240-1-Ig | |
| 裂解的caspase-8抗体 | Cell Signaling Technology | 8592 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 裂解的caspase-3抗体 | Servicebio | GB11532 | |
| 免疫荧光 | 抗肌球蛋白重链1抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | -- |
| Alexa Fluor 594标记二抗 | Zhongshan Golden Bridge | ZF-0516 | |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | Zhongshan Golden Bridge | ZF-051 | |
| ELISA | 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | MULTISCIENCES | EK282 |
| TUNEL染色 | DeadEnd™荧光TUNEL系统 | Promega | G3250 |
| LDH释放实验 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| Hoechst 33342/PI双染 | Hoechst 33342/PI双染试剂盒 | Solarbio | -- |
| 药物处理 | 重组小鼠TNF-α | PeproTech | -- |
| Z-DEVD-FMK | ApexBio Technology | A1920 | |
| Z-IETD-FMK | ApexBio Technology | B3232 | |
| GSK'872 | MedChemExpress | -- | |
| TGF-β激活激酶1抑制剂5Z-7-Oxozeaenol | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞培养 | C2C12成肌细胞系 | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CL-0044 |
| 杜氏改良Eagle培养基 | BasalMedia Technologies Co., LTD | -- | |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Meilunbio | -- | |
| 马血清 | Procell | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | Cell Signaling Technology | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 冷冻研磨仪 | Servicebio Technology | KZ-III-FP | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| ECL化学发光试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 动物实验 | C57/BL6J小鼠 | Shanghai SLACCAS Laboratory Animal Co., Ltd | SCXK |
| 抓力测试 | 小鼠抓力计 | Nuoleixinda | YLS13A |
| 组织学分析 | 尼康Eclipse E200显微镜 | Nikon | -- |
| 蔡司激光共聚焦扫描显微镜 | Zeiss | LSM800 | |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜 | HITACHI | HT7800 |
| 免疫荧光 | 尼康Eclipse TS2R显微镜 | Nikon | -- |
| 慢病毒转染 | GSDME敲低慢病毒 | Zolgene Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、性别、饲养条件、肌肉减少症评估指标 阅读提示：Materials and methods: Animal model and experimental design |
| 细胞培养与分化 | C2C12细胞来源、培养条件、分化诱导方法、分化时间 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, differentiation and treatment |
| TNF-α处理 | TNF-α浓度（0-100 ng/ml）、处理时间（0-72小时） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, differentiation and treatment |
| 抑制实验 | caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK浓度（50 μM）、caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK浓度（50 μM）、RIPK3抑制剂GSK'872浓度（1 μM）及预处理时间 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, differentiation and treatment |
| GSDME敲低 | shRNA序列、慢病毒MOI、嘌呤霉素筛选浓度 阅读提示：Materials and methods: Stable GSDME knockdown cell lines construction and differentiation |
| Western blot | 抗体稀释比例、蛋白上样量、凝胶浓度 阅读提示：Materials and methods: Western blot |