体内CA/CPR模型建立及JS-K剂量反应
确定JS-K的最佳给药剂量及观察其对生存率和炎症反应的影响。
雄性C57BL/6小鼠进行CA/CPR，ROSC后1小时静脉注射JS-K（2、4、8 μmol/kg），监测7天生存率；选取4 μmol/kg进行后续实验，24小时后ELISA检测血清炎症因子，并测量内皮NO含量。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一氧化氮供体通过抑制HMGB1-ATG5介导的内皮自噬减轻心脏骤停诱导的血脑屏障损伤
Nitric Oxide Donor Alleviates Cardiac Arrest Induced Blood Brain Barrier Injury by Inhibiting HMGB1-ATG5 Mediated Endothelial Autophagy.
实验完整度
高包含体内CA/CPR小鼠模型、体外OGD/R细胞模型、透射电镜、Western blot、免疫共沉淀、分子对接及ATG5敲低的功能验证和机制验证，证据层级多元。
主要模型
小鼠心脏骤停/心肺复苏（CA/CPR）模型 bEnd.3小鼠脑微血管内皮细胞OGD/R模型 体外BBB模型（Transwell）
重点核对
JS-K剂量：4 μmol/kg（小鼠静脉注射，于ROSC后1小时）；体外5 μM ATG5敲低：AAV9P31-shATG5（1×10^12 vg/ml, 100 μl）尾静脉注射，于CA/CPR前14天；si-ATG5转染（50 nM） HMGB1核质转位检测：Western blot及免疫荧光 BBB功能评价：Evans Blue渗漏、脑水含量、FITC-dextran通透性、TEER 自噬检测：LC3B-II、LAMP2、RFP-mWasabi-LC3、TEM
摘要
心脏骤停（CA）及随后的心肺复苏（CPR）常因缺血再灌注（I/R）损伤而致严重神经功能缺损，其特点是全身炎症、血脑屏障（BBB）功能障碍和过度自噬。JS-K是一种释放一氧化氮的前体药物，已显示出细胞保护作用，但其在CA诱导的脑损伤中的作用仍不清楚。在此，我们在小鼠CA/CPR模型和体外氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型中研究了JS-K的治疗潜力。JS-K治疗改善了神经功能结局，保持了BBB功能，并延长了生存期。机制上，JS-K在体内和体外均保持了紧密连接蛋白并改善了BBB功能，抑制了内皮细胞自噬。进一步分析显示，HMGB1在核-质转位后与ATG5相互作用，诱导过度自噬和BBB损伤。JS-K抑制HMGB1转位，减少HMGB1-ATG5相互作用，从而减轻自噬驱动的BBB功能障碍。值得注意的是，ATG5沉默未能增强JS-K的保护作用，支持JS-K至少部分通过HMGB1-ATG5轴发挥作用。这些发现将JS-K确定为一种有前景的治疗剂，靶向HMGB1介导的自噬以保护心脏骤停后的BBB功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- JS-K能否通过调节HMGB1核质转位和HMGB1-ATG5介导的内皮自噬来减轻心脏骤停后的血脑屏障损伤并改善神经功能结局？
- 核心机制
- CA/CPR或OGD/R诱导HMGB1从细胞核转位至细胞质，与ATG5相互作用，导致内皮细胞过度自噬和BBB功能障碍；JS-K抑制HMGB1核质转位，减少HMGB1-ATG5相互作用，从而抑制内皮过度自噬并保护BBB功能。
- 主要证据
- 在CA/CPR小鼠和OGD/R处理的bEnd.3细胞中，JS-K降低HMGB1胞质水平、减少HMGB1-ATG5共沉淀、降低LC3B-II和LAMP2表达，并改善BBB通透性和紧密连接蛋白（occludin、ZO-1）表达；ATG5敲低未增强JS-K的保护作用，表明其作用依赖于HMGB1-ATG5轴。
- 研究意义
- 该研究为心脏骤停后脑损伤机制提供了新见解，并提示JS-K作为改善心脏骤停后神经功能结局的潜在治疗策略值得进一步研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估JS-K对神经功能和BBB功能的影响
验证JS-K是否改善CA/CPR后的神经功能、BBB完整性和脑水肿。
在CA/CPR小鼠中，于ROSC后1小时给予JS-K（4 μmol/kg）或DMSO，在多个时间点评估神经功能缺损评分（NDS）、14天生存率、新物体识别（NOR）测试；在24小时和14天评估Evans Blue渗漏、脑水含量、紧密连接蛋白表达（Western blot）、免疫荧光共定位、TEM观察超微结构。
体外OGD/R模型验证JS-K对内皮功能的作用
在细胞层面验证JS-K对OGD/R诱导的内皮损伤的保护作用及机制。
bEnd.3细胞进行OGD（4小时）和复氧（12小时），JS-K处理（5 μM），检测细胞活力（CCK-8）、NO含量、FITC-dextran通透性、TEER、迁移、管形成、ROS水平。
验证JS-K对HMGB1核质转位的影响
探究JS-K是否抑制HMGB1从细胞核向细胞质转位。
在体内脑微血管和体外bEnd.3细胞中，提取核质蛋白进行Western blot检测HMGB1分布，并通过免疫荧光观察HMGB1亚细胞定位。
检测JS-K对内皮自噬的影响
验证JS-K是否抑制过度自噬。
在体内脑微血管和体外bEnd.3细胞中，Western blot检测LC3B-II、LAMP2水平，RFP-mWasabi-LC3荧光检测自噬通量，TEM观察自噬小体/自噬溶酶体。
验证HMGB1转位在自噬和内皮功能中的作用
使用leptomycin B抑制HMGB1核输出，验证HMGB1胞质转位对内皮自噬和功能的影响。
bEnd.3细胞在OGD/R时用leptomycin B（0.5 nM）处理，检测HMGB1分布、自噬标志物、紧密连接蛋白、通透性、迁移和管形成。
验证HMGB1与ATG5的相互作用
评估HMGB1与ATG5是否相互作用及其对自噬的调控。
使用STRING数据库预测和分子对接分析HMGB1与ATG5的结合，通过co-IP在OGD/R条件下验证相互作用，并检测leptomycin B对HMGB1-ATG5结合的影响。
验证ATG5敲低对内皮功能和BBB的保护作用
确定ATG5介导的自噬抑制是否独立于HMGB1转位而保护内皮功能。
在bEnd.3细胞中转染si-ATG5，进行OGD/R，检测HMGB1分布、自噬标志物、紧密连接蛋白、迁移、管形成、通透性；在小鼠中通过AAV-shATG5预处理，14天后行CA/CPR，检测BBB渗漏、脑水含量及蛋白表达。
验证JS-K保护作用依赖于HMGB1-ATG5轴
确定ATG5沉默是否会消除JS-K的保护效果。
bEnd.3细胞在OGD/R下用JS-K（5 μM）和si-ATG5单独或联合处理，检测细胞活力、紧密连接蛋白、HMGB1分布、通透性和ROS水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | JS-K | Sigma-Aldrich | J4137 |
| 来普霉素B | MedChemExpress | HY-16909 | |
| 动物实验 | AAV9P31-shATG5 | GeneChem | -- |
| 炎症因子检测 | ELISA试剂盒 | Jingmei | -- |
| NO含量检测 | NO检测试剂盒 | Beyotime | S0023 |
| 动物实验 | 伊文思蓝 | Sigma | E2129 |
| 细胞培养 | bEnd.3细胞系 | Procell | GCL-0598 |
| DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| 胎牛血清 | Adamas | C8010 | |
| 青霉素-链霉素 | New Cell & Molecular Biotech | C100C5 | |
| 无糖培养基 | Procell | GPM150270 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | New Cell & Molecular Biotech | C6005 |
| 自噬检测 | RFP-mWasabi-LC3慢病毒 | Genechem | -- |
| RNA干扰 | ATG5小干扰RNA | RiboBio | -- |
| X-treme GENE siRNA转染试剂 | RiboBio | R10035.7 | |
| 体外BBB模型 | Transwell膜 | Corning | 353095 |
| FITC-葡聚糖 | Sigma | FD40 | |
| TEER测量 | cellZscope E | nanoAnalytics GmbH | -- |
| 迁移实验 | Transwell小室 | BD Biosciences | 353097 |
| 管形成实验 | 基质胶 | Corning | 356234 |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | S0033M |
| 蛋白提取 | 核质蛋白提取试剂盒 | Wanleibio | WLA020a |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| western blot检测 | 增强化学发光试剂盒 | New Cell & Molecular Biotech | P10300 |
| 免疫共沉淀 | Beyotime免疫沉淀试剂盒 | Beyotime | P2179S |
| 实验用抗体 | 抗HMGB1抗体（兔） | Proteintech | 10829-1-AP |
| 抗ATG5抗体（兔） | Proteintech | 10181-2-AP | |
| 抗HMGB1抗体（鼠） | Proteintech | 66525-1-Ig | |
| 抗ATG5抗体（鼠） | Proteintech | 66744-1-Ig | |
| 抗Occludin抗体 | Proteintech | 13409-1-AP | |
| 抗ZO-1抗体 | Proteintech | 21773-1-AP | |
| 抗LC3B抗体 | CST | #3868 | |
| 抗LAMP2抗体 | Bioss | bs-2379R | |
| 抗β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| 抗Histone H3抗体 | Bioss | bs-0349R | |
| 免疫荧光 | 抗CD31抗体 | Servicebio | GB11063-2 |
| 抗occludin抗体（CST） | CST | #68534 | |
| 抗ZO-1抗体（Santa Cruz） | Santa Cruz | sc-33725 | |
| Cy3标记驴抗兔IgG | Servicebio | GB21303 | |
| FITC标记驴抗大鼠IgG | Servicebio | GB22302 | |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| 图像采集 | EVOS M3000成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 透射电镜 | 日立HT7700 | Hitachi | -- |
| 分子对接 | Discovery Studio 2019 | -- | -- |
| GRAMM | -- | -- | |
| PyMOL 3.1 | -- | -- | |
| STRING数据库 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6）、性别（雄性）、年龄（6-8周龄）、体重（25-28g）、CA/CPR操作细节（氯化钾诱导、6分钟CA、肾上腺素剂量、胸外按压频率）、ROSC成功标准。 阅读提示：Materials and Methods中的Animal Grouping and Cardiac Arrest/Resuscitation Model in Mice部分 |
| 药物处理 | JS-K剂量（4 μmol/kg）、给药途径（静脉注射）、给药时间（ROSC后1小时）；体外JS-K浓度（5 μM）；leptomycin B浓度（0.5 nM）。 阅读提示：Materials and Methods的Reagents和Cell Culture and Oxygen–Glucose Deprivation/Reoxygenation Model部分 |
| 基因敲低 | AAV9P31-shATG5滴度（1×10^12 vg/ml，100 μl）、给药途径（尾静脉）、给药时间（CA/CPR前14天）；si-ATG5浓度（50 nM）和转染试剂。 阅读提示：Materials and Methods的Tail Vein Injection Of Adeno-associated Virus (AAV)和Transient Transfection and RNA Interference部分 |
| 体外OGD/R模型 | bEnd.3细胞来源（Procell）、培养条件（DMEM+10%FBS）、OGD时长（4小时）、复氧时长（12小时）、无糖培养基。 阅读提示：Materials and Methods的Cell Culture and Oxygen–Glucose Deprivation/Reoxygenation Model部分 |
| BBB功能测定 | Evans Blue剂量（4 ml/kg 2%）、循环时间（1小时）、测量波长（620nm）；FITC-dextran浓度（1 μM，40 kDa）；TEER测量系统（cellZscope E）。 阅读提示：Materials and Methods的Evans Blue Leakage和In Vitro BBB Model部分 |