获取不同成熟阶段的颗粒细胞和卵母细胞
建立体外成熟模型，获得猪和小鼠不同卵泡阶段的颗粒细胞和卵母细胞。
从猪卵巢抽取3-6mm卵泡获得pCOCs，进行体外成熟培养42-44小时，分离排卵期pGCs和MII卵母细胞；小鼠注射PMSG和hCG诱导超排，分别收集窦状卵泡期和排卵期的mGCs和卵母细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Fosl2促进染色质可及性以决定卵泡成熟过程中的发育事件
Fosl2 facilitates chromatin accessibility to determine developmental events during follicular maturation.
实验完整度
高包含体外猪卵母细胞-颗粒细胞培养、ATAC-seq/CUT&Tag/RNA-seq/scRNA-seq多组学、Fosl2敲低和GC特异性敲除小鼠体内验证等至少两个独立证据层级。
主要模型
猪颗粒细胞（pGCs） 小鼠颗粒细胞（mGCs） Cyp19a1-Cre; Fosl2flox/flox条件敲除小鼠 猪卵母细胞-颗粒细胞复合体（pCOCs）
重点核对
Fosl2在pGCs中的敲低效率及对GAA可及性和GDG表达的影响 GC特异性Fosl2敲除小鼠的构建验证（Cyp19a1-Cre; Fosl2flox/flox） 小鼠繁殖实验的配龄时间和产仔数记录（6个月连续交配） scRNA-seq中GC亚群的鉴定和比例变化（mural和atretic GCs） ATAC-seq和CUT&Tag文库制备的细胞数量和测序深度
摘要
颗粒细胞（GC）是促进持续卵泡发生的最具动态响应的细胞谱系；然而，发育动态及其与下游转录调控网络的相互作用仍不清楚。在这里，我们揭示了在小鼠和猪颗粒细胞卵泡成熟过程中，全基因组染色质区域的重新分布驱动了广泛的发育相关转录组改变。排卵期特有的GC激活可及性区域（GAAs）负责增强侧翼的GC参与发育基因（GDG）的表达，这对于响应发育信号的转录是必需的。机制上，转录因子Fosl2被强烈招募到GAAs，促进染色质可及性状态转变。由Fosl2负载驱动的GAA信号升高诱导相邻GDG表达的显著上调。此外，小鼠GC特异性Fosl2缺失扰乱了GC细胞组成，导致与生殖衰老相关的生育力低下。总之，我们强调了卵泡成熟过程中动态的染色质可及性图谱，揭示了Fosl2不可或缺的功能，不仅通过重构染色质状态控制转录激活，还协调对排卵和生殖至关重要的复杂信号通路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在卵泡成熟过程中，颗粒细胞染色质可及性如何动态变化，以及转录因子Fosl2在其中发挥何种调控作用？
- 核心机制
- Fosl2被招募到GC激活的可及性区域（GAAs），促进染色质从关闭到开放的状态转变，从而增强邻近GDG的表达，并协调下游发育相关信号通路。
- 主要证据
- 通过ATAC-seq和CUT&Tag分析发现GAAs在排卵期显著增加且富含Fosl2结合位点；Fosl2敲低导致GAA可及性和GDG表达下降；小鼠GC特异性Fosl2敲除导致GC亚群组成异常、排卵障碍和卵巢衰老表型。
- 研究意义
- 该研究揭示了Fosl2驱动的染色质可及性在卵泡成熟中的关键作用，为理解卵巢衰老和相关生殖疾病提供了新的机制见解，并可能为评估卵母细胞质量和预测妊娠结局提供潜在参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
表征染色质可及性和组蛋白修饰的动态变化
分析颗粒细胞在卵泡成熟过程中全基因组染色质可及性和启动子/增强子活性的变化。
对猪和小鼠颗粒细胞进行ATAC-seq、H3K4me3和H3K27ac CUT&Tag，鉴定差异开放区域（DARs），并分析其与基因表达的关系。
鉴定GAA相关基因和富集通路
确定GAA邻近基因的功能特征，验证GAA对下游基因表达的调控作用。
通过GO和GREAT分析GAA和GIA相关基因，定义GDGs列表，验证GAA邻近基因表达变化，并用ChIP-qPCR验证H3K4me3水平。
验证Fosl2在GAAs的富集和功能
确定Fosl2是否作为关键转录因子调控GAA活性及下游基因表达。
通过HOMER基序分析、Fosl2 CUT&Tag检测全基因组结合，并用siRNA敲低pGCs中Fosl2，进行ATAC-seq和RNA-seq分析GAA和GDG变化。
评估Fosl2缺失对小鼠繁殖和卵巢衰老的影响
在体内验证Fosl2对生育力和卵巢功能的作用。
构建GC特异性Fosl2敲除小鼠（Fosl2cKO），进行连续交配实验、超排处理、卵巢组织学分析，并进行scRNA-seq分析GC亚群变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM-F12培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| β-雌二醇 | 文中未明确说明 | -- | |
| 孕马血清促性腺激素 | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| 人绒毛膜促性腺激素 | Sigma-Aldrich | 9002-61-3 | |
| 表皮生长因子 | Sigma | -- | |
| 体外成熟培养基 | Gibco | 3110-035 | |
| 聚乙烯醇 | Sigma | P8136 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S5761 | |
| D-葡萄糖 | Sigma | G7021 | |
| 庆大霉素 | Sigma | G1264 | |
| 半胱氨酸 | Sigma | C7352 | |
| 促黄体生成素 | Sigma | L5269 | |
| 促卵泡激素 | Sigma | F2293 | |
| 矿物油 | 文中未明确说明 | -- | |
| 透明质酸酶 | 文中未明确说明 | -- | |
| M2培养基 | 文中未明确说明 | -- | |
| IBMX | 文中未明确说明 | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 | |
| 组织学分析 | DAPI | 文中未明确说明 | -- |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Fisher | 89901 |
| SDS上样缓冲液 | Beyotime | P0015L | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 脱脂牛奶 | 文中未明确说明 | -- | |
| Fosl2抗体 | CST | 19967 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| iBright成像系统 | Thermo Fisher | -- | |
| RNA提取和定量 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| SYBR Green I主混合物 | Roche | 04707516001 | |
| RNA-seq | Illumina RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7770 |
| Novaseq 6000测序平台 | Novogene | -- | |
| ChIP-qPCR | H3K4me3抗体 | Abcam | ab8580 |
| H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 | |
| IgG抗体 | Proteintech | 30000-0-AP | |
| Protein A Sepharose珠浆 | Sigma-Aldrich | GE17-5280 | |
| scRNA-seq | Chromium单细胞3'文库和凝胶珠试剂盒v3 | 10x Genomics | 120237 |
| Chromium控制器 | 10x Genomics | -- | |
| ATAC-seq | Tn5转座体 | Vazyme | TD501 |
| AMPure磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 高效核分离试剂盒 | SHBIO | 52009 | |
| CUT&Tag | 用于Illumina的CUT&Tag检测试剂盒 | Vazyme | TD903 |
| 免疫荧光染色 | FSHR抗体 | Proteintech | 22665 |
| MAPK1抗体 | Proteintech | 51068-1-AP | |
| FTO抗体 | Proteintech | 27226-1-AP | |
| INHBA抗体 | Bioss | bs-1774R | |
| GHR抗体 | Bioss | bs-0654R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞获取与培养 | 猪卵泡直径、IVM培养基组成、培养时间；小鼠PMSG和hCG剂量、注射间隔和收集时间 阅读提示：Methods部分Collection of porcine cumulus-oocyte complexes和Maturation of porcine GCs and oocytes，以及The acquisition of mGCs and oocytes |
| ATAC-seq和CUT&Tag | 细胞数量、Tn5转座反应条件、PCR循环数、测序深度 阅读提示：Methods部分ATAC-seq library generation和CUT&Tag library generation |
| Fosl2敲低 | siRNA序列、转染试剂、转染时间、细胞培养条件 阅读提示：Methods部分RNA interference |
| 小鼠模型 | Cyp19a1-Cre小鼠和Fosl2flox/flox小鼠的繁殖策略、基因型鉴定方法 阅读提示：Methods部分Mice |
| 生育力测试和超排 | 交配持续时间、产仔数记录；超排处理中PMSG和hCG的剂量和注射时间 阅读提示：Methods部分Fertility test和The acquisition of mGCs and oocytes |
| scRNA-seq分析 | 样本数量（n=2/组）、细胞活力标准、文库制备试剂盒版本、测序深度、聚类参数 阅读提示：Methods部分scRNA-seq library preparation和Data analysis中的scRNA-seq data processing |