CAF样细胞的制备与验证
通过OS细胞条件培养基将正常成纤维细胞激活为CAF样细胞，并验证其活化特征。
用HOS/143B条件培养基处理WI-38和HELF细胞48小时，通过qPCR、Western blot检测CAF标志物（α-SMA、FAP、FN1），免疫荧光检测α-SMA表达，并检测IL-6/STAT3和TGF-β/Smad2通路激活。
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癌症相关成纤维细胞样细胞通过上调磷酸丝氨酸氨基转移酶1和激活mTOR/S6K通路促进骨肉瘤转移
Cancer-associated Fibroblast-like Cells Promote Osteosarcoma Metastasis by Upregulation of Phosphoserine Aminotransferase 1 and Activation of the mTOR/S6K Pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（迁移、EMT、机制验证）、代谢组学、体内肺转移模型及临床样本分析，多层级验证。
主要模型
WI-38和HELF人胚肺成纤维细胞经HOS/143B条件培养基激活的CAF样细胞 HOS和143B人骨肉瘤细胞系 BALB/c裸鼠尾静脉注射143B细胞的肺转移模型 骨肉瘤患者原发肿瘤及肺转移组织样本
重点核对
CAF样细胞激活：WI-38和HELF细胞用HOS/143B条件培养基处理48小时，验证α-SMA、FAP、FN1表达升高 PSAT1敲低：siRNA转染HOS和143B细胞，6小时后更换为含10% FBS的CAF-CM，培养36小时进行迁移和EMT检测 mTOR通路抑制：使用雷帕霉素（RAPA）浓度0.1和1 μM处理，抑制S6K磷酸化 体内实验：BALB/c裸鼠（雌性，6周龄），尾静脉注射2×10^6 143B细胞（与或不与等量CAF样细胞混合），或PSAT1过表达细胞，RAPA剂量2 mg/kg腹腔注射，每周三次，持续四周 PSAT1蛋白稳定性：CHX（100 μg/mL）处理0、4、12、24小时检测mTOR降解
摘要
转移仍然是限制骨肉瘤（OS）患者生存的主要障碍。癌症相关成纤维细胞（CAFs）与OS细胞之间的相互作用已被发现可促进转移，尽管CAFs对OS细胞代谢的影响知之甚少。在此，使用OS细胞的条件培养基激活CAF样细胞，发现其促进OS迁移和上皮-间质转化。代谢组学分析显示，用CAFs条件培养基处理OS细胞显著改变了磷酸丝氨酸氨基转移酶1（PSAT1）的水平，这是一种关键的丝氨酸合成酶。通过siRNA敲低PSAT1可抑制CAF诱导的OS细胞迁移，并且发现PSAT1通过PI3K/mTOR/S6K通路促进迁移。在体外和体内，PSAT1敲低和mTOR抑制剂均可阻断CAFs对OS转移的影响。总之，研究结果表明PSAT1和mTOR/S6K通路具有作为预防OS转移靶点的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CAFs对骨肉瘤细胞代谢的影响及其在骨肉瘤转移中的作用机制是什么？
- 核心机制
- CAF样细胞通过上调骨肉瘤细胞中PSAT1表达，进而稳定mTOR蛋白并激活PI3K/mTOR/S6K通路，促进骨肉瘤细胞迁移、EMT和肺转移。
- 主要证据
- 代谢组学显示CAF-CM处理改变血清代谢；PSAT1在OS组织和细胞中高表达；siRNA敲低PSAT1抑制迁移和EMT；PSAT1过表达促进迁移，雷帕霉素抑制mTOR通路可阻断此效应；体内模型中PSAT1过表达促进肺转移，雷帕霉素减少转移。
- 研究意义
- 该研究提示PSAT1和mTOR/S6K通路可作为预防骨肉瘤转移的潜在治疗靶点，为开发靶向PSAT1或联合mTOR抑制剂的策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CAF-CM对OS细胞增殖和迁移的影响
评估CAF样细胞对骨肉瘤细胞增殖、迁移和EMT的影响。
用CAF-CM处理HOS和143B细胞，进行CCK-8、克隆形成、伤口愈合和Transwell实验，并通过Western blot检测EMT标志物。
代谢组学分析
分析CAF-CM处理对OS细胞代谢谱的影响，寻找关键代谢通路和酶。
对CAF-CM或WI-38-CM处理的HOS细胞进行非靶向LC-MS代谢组学，通过PCA、PLS-DA、KEGG和MSEA分析差异代谢物和通路，并用qPCR验证丝氨酸和甲硫氨酸代谢关键酶表达。
PSAT1表达验证及临床关联分析
验证PSAT1在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及其与CAFs和预后的关系。
利用GEO和TCGA数据库分析PSAT1表达与生存；在10对OS原发肿瘤和7对肺转移样本中检测PSAT1表达，并与α-SMA关联。
PSAT1敲低的体外功能实验
验证PSAT1在CAF-CM诱导的OS细胞迁移和EMT中的作用。
用siRNA敲低HOS和143B细胞中的PSAT1，转染6小时后更换为CAF-CM，通过伤口愈合和Transwell检测迁移，Western blot检测EMT标志物。
mTOR/S6K通路机制验证
探究PSAT1促进OS迁移是否依赖mTOR/S6K通路及其机制。
GSEA分析PSAT1相关通路；检测PSAT1敲低对mTOR mRNA和蛋白稳定性的影响（CHX chase）；Western blot检测PI3K/mTOR/S6K磷酸化；通过PSAT1过表达和雷帕霉素抑制进行功能验证。
体内肺转移模型验证
验证PSAT1和mTOR抑制对骨肉瘤肺转移的影响。
BALB/c裸鼠尾静脉注射143B细胞（与CAF样细胞混合），或PSAT1过表达细胞；给予PBS或雷帕霉素治疗，检测肺转移结节数和生物发光成像。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 10566016 |
| MEM培养基 | HyClone | SH30024.01 | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | C04001-500 | |
| 青霉素/链霉素 | Biosharp | BL505A | |
| CAF激活 | 0.22 µm过滤器 | Biosharp | BS-PES-22 |
| 原代细胞分离 | IV型胶原酶 | Sigma Aldrich | C5138-100MG |
| M199培养基 | Hyclone | SH30253.01 | |
| qPCR | TRIzol试剂 | Sigma | T9424 |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher | -- | |
| HiScript III逆转录预混液（含gDNA去除） | Vazyme | R323 | |
| ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q311 | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | GeneAmp 9700 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Beyotime | P1045 | |
| ECL发光试剂 | Bio-Rad | 1705061 | |
| 红外成像系统 | UPV ChemiDoc-It 510 | -- | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 纤连蛋白抗体 | Proteintech | 15613-1-AP | |
| Smad2抗体 | Proteintech | 12570-1-AP | |
| E-钙粘蛋白抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| N-钙粘蛋白抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| 波形蛋白抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| PSAT1抗体 | Proteintech | 67619-1-Ig | |
| mTOR抗体 | Proteintech | 28273-1-AP | |
| 磷酸化mTOR (Ser2448)抗体 | Proteintech | 67778-1-Ig | |
| α-SMA抗体 | Abcam | ab7817 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abclonal | AC006 | |
| STAT3抗体 | Abclonal | A1192 | |
| 磷酸化PI3K抗体 | Abclonal | AP0854 | |
| FAP抗体 | Affinity | AF0739 | |
| IL-6抗体 | Affinity | DF6087 | |
| 磷酸化STAT3 (Ser727)抗体 | Affinity | AF3294 | |
| 磷酸化S6K (Thr389/Thr412)抗体 | Affinity | AF3228 | |
| TGF-β抗体 | Bioss | bs-0086R | |
| 磷酸化Smad2 (Ser465)抗体 | Bioss | bs-2224R | |
| TGFBR抗体 | CST | 5544 | |
| PI3K抗体 | CST | 4292 | |
| HRP标记二抗 | Servicebio | GB23301/GB23303 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Beyotime | P0096 |
| α-SMA抗体（IF） | Abclonal | A17910 | |
| Cy3标记二抗 | Abclonal | AS007 | |
| Hoechst染料 | Beyotime | C1017 | |
| Cy5标记二抗 | 文中未明确说明 | -- | |
| HRP标记二抗 | Servicebio | GB23303 | |
| FITC-酪胺信号放大染料 | Servicebio | G1222 | |
| Cy3标记二抗（IF） | Servicebio | GB21303 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX53 | |
| CCK-8 | CCK-8试剂盒 | Biosharp | BS350B |
| 酶标仪 | PerkinElmer | Enspire | |
| 体内实验 | 雷帕霉素 | Selleck | AY-22989 |
| IVIS Lumina K系列III成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| 代谢组学 | ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱 | Waters | -- |
| 细胞因子检测 | magEasyQPlex人14因子流式检测试剂盒 | Laizee Biotech | PLEM100 |
| TGF-β ELISA试剂盒 | Laizee Biotech | LER822-1 | |
| 药理学抑制 | SB431542 | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CAF激活 | CAF样细胞由WI-38或HELF细胞经HOS/143B条件培养基处理48小时诱导，需确认细胞代数（2-6代）和条件培养基制备细节。 阅读提示：Methods: CAF activation via external stimulation; Figure 1 |
| 细胞迁移实验 | 伤口愈合和Transwell实验的具体条件：细胞数量、处理时间、血清浓度。 阅读提示：Methods: Wound-healing assay, Transwell assay; Figure 2 |
| 代谢组学 | LC-MS非靶向代谢组学的样本制备和处理时间（HOS细胞处理36小时，200 mg/样品）。 阅读提示：Methods: Metabolomics analysis; Figure 3 |
| PSAT1敲低 | siRNA转染条件：转染后6小时更换为CAF-CM，处理36小时。 阅读提示：Methods: siRNA transfection (implied); Figure 5 |
| mTOR通路抑制 | 雷帕霉素浓度（0.1和1 μM）和处理时间；体内剂量（2 mg/kg，每周三次，四周）。 阅读提示：Methods: Results section 'PSAT1 promotion...mTOR/S6K activation'; Figure 6, 7 |
| 体内肺转移模型 | BALB/c裸鼠（雌性，6周龄），尾静脉注射2×10^6 143B细胞（±CAF样细胞），PSAT1过表达细胞，治疗周期四到六周。 阅读提示：Methods: Assays for tumor lung metastasis in vivo; Figure 7 |
| 临床样本分析 | 患者样本数量（10对原发肿瘤，7对肺转移），PSAT1免疫组化和免疫荧光条件。 阅读提示：Methods: Tissue immunohistochemistry and immunofluorescence analysis; Figure 4 |