验证β-catenin在AML和耐药细胞中的异常表达
评估β-catenin在AML患者和耐药细胞中的表达水平及其与预后的相关性。
通过数据库分析和RT-qPCR、Western blotting检测AML患者和健康供者样本中β-catenin的表达，并在MOLM13-R细胞中比较其与亲本细胞的差异。
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维奈克拉与Wnt/β-catenin抑制剂C-82在急性髓系白血病中通过增加Mcl-1蛋白降解协同作用
Venetoclax synergizes with Wnt/β-catenin inhibitor C-82 in acute myeloid leukemia by increasing the degradation of Mcl-1 protein.
实验完整度
高包含细胞系体外实验、耐药细胞模型、患者样本分析、动物模型和多种机制验证（如泛素化、蛋白稳定性、信号通路）。
主要模型
MOLM13细胞系 NOMO1细胞系 MOLM13耐维奈克拉细胞系（MOLM13-R） MOLM13异种移植NOD/SCID小鼠模型
重点核对
MOLM13-R细胞耐药性建立：逐步增加VEN浓度处理，持续6个月，三周三次 β-catenin敲低增强VEN诱导的凋亡：siRNA转染后VEN处理24小时 C-82与VEN协同浓度：MOLM13中C-82 600 nM，VEN 50 nM；NOMO1中C-82 300 nM，VEN 2.5 μM，处理24小时 体内实验：NOD/SCID小鼠皮下接种MOLM13细胞，当肿瘤体积达80-100 mm³时分组，每组5只，PRI-724 35 mg/kg腹腔注射隔日一次，VEN 100 mg/kg灌胃每日一次
摘要
背景：由于补偿性生存信号和抗凋亡Bcl-2家族蛋白的过表达，大多数AML患者对维奈克拉（VEN）与低剂量阿糖胞苷（LDAC）或去甲基化药物（HMAs）联合治疗产生了获得性耐药。Wnt/β-catenin信号通路的失调与白血病发展和化疗耐药密切相关。然而，目前尚无Wnt/β-catenin抑制剂获批用于临床，且靶向Wnt/β-catenin通路是否能增强VEN的抗白血病活性尚不清楚。方法：分析BeatAML和GEO数据库中AML患者的数据。基于MOLM13亲本细胞系建立MOLM13维奈克拉耐药细胞系（MOLM13-R细胞）。采用CCK-8、Annexin-V/PI和Western blotting评估Wnt/β-catenin抑制剂C-82与VEN联合在AML细胞系中的作用。通过Western blotting和泛素化免疫沉淀探索两药联合协同作用的潜在机制。结果：我们发现β-catenin在AML患者和MOLM13-R细胞中表达异常上调。敲低β-catenin可增加MOLM13-R细胞的凋亡。C-82与VEN联合治疗协同抑制AML细胞生长并增加凋亡。机制上，C-82破坏了Mcl-1蛋白的稳定性，Mcl-1下调与Mcl-1的不同磷酸化位点和蛋白酶体降解相关。C-82和VEN的联合治疗协同诱导了线粒体相关凋亡和gasdermin E（GSDME）依赖性焦亡。结论：我们的研究为AML患者提出了一种有效的治疗策略，即C-82和VEN联合使用，将该方案定位为一种有前景的治疗选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 靶向Wnt/β-catenin通路是否能增强Bcl-2抑制剂维奈克拉在AML中的抗白血病活性，并探讨其潜在机制。
- 核心机制
- C-82通过抑制ERK介导的Mcl-1 Thr163磷酸化，联合VEN时进一步促进GSK3β介导的Ser159磷酸化，从而增加Mcl-1的泛素-蛋白酶体降解，并激活Caspase-3介导的GSDME裂解，诱导凋亡和焦亡。
- 主要证据
- 在MOLM13和NOMO1细胞中，C-82和VEN联合显著抑制细胞活力并诱导凋亡；Western blotting显示Mcl-1蛋白水平降低且泛素化增加；动物模型中联合治疗显著减小肿瘤体积并增加cleaved Caspase-3和cleaved PARP表达。
- 研究意义
- 作者提出C-82与VEN联合治疗是AML的一种有效治疗策略，尤其针对VEN耐药，为AML管理提供了有前景的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证β-catenin敲低对VEN敏感性的影响
探讨β-catenin表达降低是否增强MOLM13-R细胞对VEN的敏感性。
使用siRNA转染敲低MOLM13-R细胞中β-catenin，检测敲低效率及VEN处理后细胞凋亡变化。
评估C-82与VEN联合的协同抗白血病作用
检测C-82与VEN联合是否在体外协同抑制AML细胞生长并诱导凋亡。
用不同浓度C-82和VEN处理MOLM13和NOMO1细胞，CCK-8检测活力，计算Bliss_Loewe评分和CI值，流式细胞术检测凋亡。
探究C-82降低Mcl-1蛋白的机制
阐明C-82是否通过影响Mcl-1蛋白稳定性促进其降解。
使用CHX（10 μg/ml）检测Mcl-1半衰期，MG-132（1 μM）抑制蛋白酶体，进行泛素化免疫沉淀分析。
验证联合治疗对Mcl-1磷酸化位点的影响
探究C-82/VEN联合是否通过调节ERK和GSK3介导的Mcl-1磷酸化促进其降解。
Western blotting检测ERK、GSK3、Mcl-1及磷酸化位点（Thr163和Ser159），并检测PI3K-Akt通路相关蛋白。
评估联合治疗诱导焦亡
确定C-82/VEN联合是否通过Caspase-3裂解GSDME诱导焦亡。
光镜观察细胞形态，检测LDH释放和GSDME-N末端片段表达。
体内验证联合治疗抗肿瘤效果
在异种移植模型中验证PRI-724（C-82前药）与VEN联合的抗肿瘤效果。
将MOLM13细胞皮下接种NOD/SCID小鼠，分组给予PRI-724和/或VEN，记录肿瘤体积并Western blotting检测肿瘤组织蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | IMDM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 维奈克拉 | MCE | -- |
| C-82 | CSNpharm | -- | |
| PRI-724 | TargetMol | -- | |
| MG-132 | Beyotime | -- | |
| Western blotting | 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig |
| 抗β-tubulin抗体 | Proteintech | 66240-1-lg | |
| 抗Mcl-1抗体 | Proteintech | 16225-1-AP | |
| 抗β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 8480 | |
| 抗PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| 抗GSK3抗体 | Cell Signaling Technology | 9315 | |
| 抗p-GSK3抗体 | Cell Signaling Technology | 9323 | |
| 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4696 | |
| 抗p-ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 2920 | |
| 抗p-Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2972S | |
| 抗p-mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2971S | |
| 抗p-Mcl-1 (Thr163)抗体 | Cell Signaling Technology | 14765 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 8081 | |
| 抗Bcl-2抗体 | Abcam | ab32124 | |
| 抗Bcl-xL抗体 | Abcam | ab32370 | |
| 抗Caspase-3抗体 | Abcam | ab184787 | |
| 抗Caspase-9抗体 | Abcam | ab202068 | |
| 抗GSDME抗体 | Abcam | ab215191 | |
| 抗p-Mcl-1 (Ser159)抗体 | Bioss | bs-18726R | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | TargetMol | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI试剂盒 | BestBio | -- |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1检测试剂盒 | Beyotime | C2003S |
| siRNA转染 | CALNP™ RNAi转染试剂 | D-Nano Therapeutics | DN001-05 |
| RT-qPCR | HyperScript III RT SuperMix逆转录试剂 | EnzyArtisan | R202-02 |
| 2×S6 Universal SYBR qPCR Mix | EnzyArtisan | Q204-01 | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Thermo fisher | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Proteintech | -- |
| 改良型Bradford蛋白定量试剂盒 | Sangon Biotech | -- | |
| SDS-PAGE凝胶 | Epizyme Biotech | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| HRP标记二抗 | Proteintech | -- | |
| ECL发光检测试剂盒 | Biosharp | -- | |
| 免疫沉淀 | 免疫沉淀缓冲液 | Beyotime | -- |
| 蛋白A/G磁珠 | MCE | -- | |
| 2×SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime | -- | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| LDH释放检测 | LDH检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 细胞活力检测 | 酶标仪 | BioTeck | -- |
| LDH释放检测 | 酶标仪 | Thermo | MultiskanGo |
| 免疫荧光 | 荧光显微镜 | Zeiss | Axio |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 耐药细胞建立 | MOLM13-R细胞：逐步增加VEN浓度处理，每周3次，共6个月 阅读提示：Methods - Cell lines and primary cells |
| β-catenin敲低实验 | siRNA序列（siCTNNB1#1和#3）及转染试剂（CALNP™ RNAi） 阅读提示：Methods - SiRNA knockdown of β-catenin |
| 联合用药体外实验 | C-82和VEN浓度：MOLM13（C-82 600 nM，VEN 50 nM）和NOMO1（C-82 300 nM，VEN 2.5 μM），处理时间24小时 阅读提示：Results - Inhibition of β-catenin expression increased the sensitivity...；图3 |
| 蛋白稳定性实验 | CHX浓度10 μg/ml；MG-132浓度1 μM（预处理4小时）或0.8 μM（预处理2小时） 阅读提示：Results - C-82 downregulated Mcl-1 expression by increasing the degradation...；图4 |
| 体内实验 | NOD/SCID小鼠，皮下接种MOLM13细胞3×10^6个；当肿瘤体积达80-100 mm³时随机分组（n=5）；PRI-724 35 mg/kg腹腔注射隔日一次；VEN 100 mg/kg灌胃每日一次 阅读提示：Methods - Animal experiments |