模型建立与表型评估
验证APP/PS1小鼠是否存在昼夜节律紊乱以及Bmal1表达变化。
使用6月龄APP/PS1和WT小鼠进行轮跑行为测试，检测Bmal1 mRNA和蛋白水平及免疫荧光。
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IL-17A通过表观遗传抑制BMAL1诱导阿尔茨海默病小鼠的昼夜节律紊乱
IL-17A Induces Circadian Disruptions Through the Epigenetic Repression of BMAL1 in Mice With Alzheimer's Disease.
实验完整度
高包括细胞模型（HT22）和动物模型（APP/PS1小鼠），并进行了功能验证（轮跑行为实验）和机制验证（DNA甲基化、Western blot、通路抑制剂等）。
主要模型
HT22小鼠海马神经元细胞系 APP/PS1转基因小鼠 C57BL/6野生型小鼠
重点核对
Aβ1-42浓度：5 μM rmIL-17A浓度：250 ng/mL 5-Aza给药剂量：32.2 ng/天，持续21天 IL-17A中和抗体给药剂量：32.50 μg/天，持续21天 AAV-BMAL1注射时间：行为测试前3周
摘要
昼夜节律紊乱和神经炎症影响几乎所有阿尔茨海默病（AD）患者，但两者之间的关系及其相互作用对AD的影响仍有待解决。本研究发现，淀粉样蛋白（A）‐β处理通过HT22细胞中Bmal1启动子区域的超甲基化下调脑和肌肉芳烃受体核转位蛋白样1（BMAL1），而抑制DNA甲基化可逆转APPswe/PSEN1dE9（APP/PS1）小鼠中Bmal1的超甲基化，从而改善昼夜节律紊乱并恢复BMAL1蛋白表达。重要的是，白细胞介素（IL）‐17A水平的升高通过其启动子区域的超甲基化促进BMAL1下调，从而导致APP/PS1小鼠的昼夜节律紊乱。此外，我们揭示丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路负责IL‐17A诱导的DNA甲基转移酶（DNMT）1上调。综上所述，我们阐明了一种连接IL‐17A与Bmal1 DNA甲基化改变的新机制，该机制导致AD小鼠模型中的昼夜节律紊乱。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IL-17A水平升高是否通过表观遗传机制抑制BMAL1表达，从而引起APP/PS1小鼠的昼夜节律紊乱？
- 核心机制
- IL-17A通过MAPK通路上调DNMT1，导致Bmal1启动子超甲基化，进而抑制BMAL1表达，引起昼夜节律紊乱。
- 主要证据
- 体外实验显示Aβ和rmIL-17A处理HT22细胞增加Bmal1甲基化并降低其表达；体内实验显示APP/PS1小鼠海马中DNMT1升高、Bmal1表达降低，5-Aza或IL-17A中和抗体处理可逆转这些变化并改善轮跑行为节律。
- 研究意义
- 首次阐明IL-17A通过表观遗传调控BMAL1导致昼夜节律紊乱的机制，为AD的潜在治疗策略提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外Aβ处理与甲基化分析
探究Aβ是否通过DNA高甲基化抑制Bmal1表达。
用5 μM Aβ1-42处理HT22细胞，检测Bmal1启动子甲基化水平（BSP、MSP）和表达水平。
5-Aza干预与功能恢复
验证抑制DNA甲基化能否恢复BMAL1表达并改善昼夜节律。
在体外用5-Aza处理HT22细胞，在体内通过icv注射5-Aza，检测Bmal1甲基化和表达，并进行轮跑行为测试。
BMAL1过表达验证
确认BMAL1在改善昼夜节律中的直接作用。
通过AAV载体在APP/PS1小鼠海马过表达BMAL1，进行轮跑行为测试。
IL-17A作用机制研究
探究IL-17A是否通过MAPK通路上调DNMT1并抑制BMAL1。
检测APP/PS1小鼠CSF中IL-17A水平，在HT22细胞中联合Aβ和rmIL-17A处理，检测DNMT1、Bmal1表达及MAPK信号通路，并使用MAPK抑制剂PD98059验证。
IL-17A中和抗体体内验证
验证中和IL-17A能否改善昼夜节律并逆转Bmal1甲基化。
对APP/PS1小鼠icv注射IL-17A中和抗体，检测Bmal1甲基化、DNMT1和BMAL1表达，并进行轮跑行为测试。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证表观遗传修饰
验证免疫效应
验证信号通路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Solarbio | P1300 | |
| 药物处理 | β-淀粉样蛋白1-42 | GL Biochem Ltd. | 52487 |
| 重组小鼠IL-17A | Novoprotein | CX14 | |
| 5-氮杂胞苷 | Selleck | S1782 | |
| 动物实验 | IL-17A中和单克隆抗体 | BioXCell | BE0173 |
| ALZET脑输注套件 | ALZET Osmotic Pumps | 0008851 | |
| RNA提取与PCR | TRIzol试剂 | Takara | TCH022 |
| PrimeScript反转录试剂盒 | Takara | RR036A | |
| TB Green快速qPCR预混液 | Takara | RR820A | |
| 蛋白质提取与定量 | RIPA裂解液 | BOSTER | AR102-100 |
| 蛋白酶抑制剂 | BOSTER | AR1178 | |
| 磷酸酶抑制剂 | BOSTER | AR1183 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | BOSTER | AR0146 | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| BMAL1抗体 | Cell Signaling Technology | D2L7G | |
| DNMT1抗体 | Cell Signaling Technology | D63A6 | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 2938 | |
| 磷酸化MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| GAPDH抗体 | Bioss | bsm-33033M | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 60008-1-Ig | |
| β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 66240-1-Ig | |
| 山羊抗小鼠IgG二抗 | ZSGB-BIO | -- | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | ZSGB-BIO | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Meilunbio | MA0186 | |
| Bio-Rad成像系统 | Bio-Rad | FluorChem E | |
| 甲基化分析 | EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒 | Qiagen | 59824 |
| EpiTect快速DNA亚硫酸氢盐试剂盒 | Qiagen | -- | |
| TIANamp基因组DNA提取试剂盒 | Tiangen | -- | |
| ELISA | 小鼠IL-17A ELISA试剂盒 | BOSTER | EK0431 |
| 免疫荧光 | BMAL1抗体 | Affinity | DF10308 |
| DAPI封片剂 | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| 免疫组化 | DNMT1抗体 | -- | -- |
| 动物实验 | AAV-CMV-BMAL1-mCherry病毒 | Hanbio Biotechnology | -- |
| AAV-CMV-mCherry对照病毒 | Hanbio Biotechnology | -- | |
| 其他 | 异氟烷 | RWD Life Science | -- |
| 数据采集 | Clocklab软件 | Actimetrics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | 6月龄APP/PS1和WT小鼠，体重18-22g，购买自南京大学模型动物研究中心 阅读提示：Materials and Methods, Animals (2.1) |
| 给药 | 5-Aza剂量：676.2 ng/动物（3周），IL-17A mAb剂量：682.5 μg/动物（3周），给药速率0.11 μL/h 阅读提示：Materials and Methods, In Vivo Drug Administration (2.2) |
| AAV注射 | AAV-BMAL1载体注射时间：行为测试前3周；双侧海马注射，坐标AP -2.0, ML ±1.8, DV -1.8 阅读提示：Materials and Methods, In Vivo Drug Administration and AAV Injection (2.2) |
| 轮跑行为测试 | 光照程序：LD 12:12 1周，DD 2周；行为数据分析：Clocklab软件 阅读提示：Materials and Methods, Wheel-Running Behavioural Test (2.3) |
| 细胞处理 | HT22细胞培养条件、Aβ1-42浓度（5 μM）、rmIL-17A浓度（250 ng/mL）、5-Aza浓度（10 μM） 阅读提示：Materials and Methods, Cell Culture and Administration (2.4) |