LTA4H通过靶向HNRNPA1/LTBP1/TGF-β轴改善肿瘤微环境并阻止肝癌进展

LTA4H improves the tumor microenvironment and prevents HCC progression via targeting the HNRNPA1/LTBP1/TGF-β axis.

作者信息Shuai Yang, Xinyao Qiu, Yingcheng Yang, Jing Wu, Shan Wang, Bo Zheng, Jianmin Wu, Tao Zhou, Yangqianwen Zhang, Mixue Bai, Shuowu Liu, Zihan Zhao, Yani Zhang, Yixian Wang, Jinxia Bao, Mengye Wu, Dongdong Xue, Meiyu Bao, Ji Hu, Siyun Shen, Hongyang Wang, Lei Chen

PMID40056904

期刊Cell Rep Med

发布时间2025-03-18

DOI10.1016/j.xcrm.2025.102000

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实验完整度

高

包含临床样本分析、小鼠肝癌模型、细胞实验、质谱流式、转录组测序及机制验证等多个独立实验层级。

主要模型

肝细胞癌患者组织样本 DEN诱导的小鼠肝癌模型 Hepa1-6细胞系肝细胞特异性LTA4H敲除小鼠

重点核对

LTA4H表达水平与肝癌预后相关性（TMA队列，n=133）肝细胞特异性LTA4H敲除对DEN诱导肝癌的影响（肿瘤数量、ALT/AST） LTA4H对JNK信号通路和LTBP1表达的调控 LTA4H对巨噬细胞极化的影响（CD206+巨噬细胞比例） TGF-β阻断联合抗PD-1治疗对肿瘤生长的抑制作用

摘要

Yang等人报道，在肝细胞癌中，LTA4H缺乏通过上调LTBP1及下游TGF-β的分泌和激活，促进CD206+巨噬细胞极化。机制上，LTA4H诱导HNRNPA1磷酸化，增强其相互作用，导致HNRNPA1在调节LTBP1 mRNA加工中的功能抑制。

临床样本中LTA4H表达与预后分析

评估LTA4H在人类肝癌组织中的表达水平及其与患者预后的关系。

利用免疫组化、蛋白印迹、实时定量PCR和ELISA检测肝癌及癌旁组织中LTA4H表达，并分析生存数据。

小鼠肝癌模型中LTA4H功能研究

研究LTA4H缺失对肝癌发生发展的影响。

构建肝细胞特异性LTA4H敲除小鼠和全敲除小鼠，使用DEN诱导肝癌，分析肿瘤负荷和肝损伤指标。

LTA4H对肝细胞损伤和JNK信号的影响

探讨LTA4H调控肝细胞损伤的分子机制。

分离原代肝细胞，进行RNA测序和信号通路分析，验证JNK、ERK、p38磷酸化水平。

LTA4H对肿瘤微环境中巨噬细胞极化的影响

研究LTA4H缺乏对肿瘤免疫微环境的塑造作用。

使用质谱流式分析和多重免疫组化检测肿瘤中免疫细胞亚群，特别是巨噬细胞极化状态。

LTA4H调控LTBP1和TGF-β分泌的机制研究

阐明LTA4H调节LTBP1表达和TGF-β分泌的分子机制。

检测LTA4H对LTBP1表达和TGF-β分泌的影响，并验证HNRNPA1的介导作用。

体内验证TGF-β阻断联合免疫治疗的疗效

评估TGF-β阻断能否改善LTA4H缺陷肝癌的免疫治疗反应。

建立原位肝癌模型，给予抗PD-1、抗TGF-β或联合治疗，分析肿瘤生长和免疫细胞浸润。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	DMEM培养基	--	--
胎牛血清	--	--
基质胶	Corning	356237
Western blot	牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4737
免疫组化	柠檬酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	C9999
蛋白提取	WB和IP裂解液	Yeasen	20118ES60
蛋白酶抑制剂混合物	Yeasen	20124ES03
磷酸酶抑制剂混合物	Yeasen	20109ES05
免疫共沉淀	Protein A + G 磁珠	MCE	HY-K0202
核糖核酸酶A/T1	Thermo Fisher	EN0551
细胞筛选	G418	Beyotime	ST081
RNA提取	TRIzol试剂	Thermo Fisher	15596026
qPCR	SYBR Green	Roche	04707516001
ELISA	TGFβ ELISA试剂盒	R&D Systems	DB100C
原代细胞分离	Liberase消化酶	Merck	05401020001
细胞培养	L-谷氨酰胺	Thermo Fisher	A2916801
药物处理	白三烯B4	Cayman	20110
JNK抑制剂	Aladdin	J125321
BLT2抑制剂	MCE	HY-15744
BLT1抑制剂	Cayman	70705
细胞裂解	ACK裂解液	Thermo Fisher	A1049201
细胞培养	巨噬细胞集落刺激因子	Novoprotein	CB34
白细胞介素-4	Novoprotein	CK74
脂多糖	Beyotime	S1732
干扰素-γ	Novoprotein	C746
细胞筛选	嘌呤霉素	Beyotime	ST551
免疫荧光	Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2883
免疫组化	Opal Polaris 7色手动IHC检测试剂盒	Akoya	NEL86100KT
DAB过氧化物酶底物试剂盒	Beyotime	P0203
凋亡检测	TUNEL凋亡试剂盒	Beyotime	C1098
qPCR	逆转录试剂盒	Yeasen	11149ES
血清生化检测	ALT活性检测试剂盒	Nanjing Jiancheng	C009-2-1
AST活性检测试剂盒	Nanjing Jiancheng	C010-2-1
RNA测序	VAHTS总RNA测序文库制备试剂盒	Vazyme	NR603
核质分离	核质提取试剂盒	Yeasen	20126ES
RNA免疫沉淀	RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒	FITGENE	FI8707
染色质免疫沉淀	染色质提取试剂盒	Abcam	ab117152
一步法磁珠ChIP试剂盒	Abcam	ab156907
DNA纯化	PCR纯化试剂盒	Beyotime	D0033
ChIP测序	NEBNext Ultra DNA文库制备试剂盒	NEB	E7645L
细胞转染	jetPRIME体外DNA和siRNA转染试剂盒	Polyplus	101000027
质谱流式	顺铂	Fluidigm	201064
Fix I缓冲液	Fluidigm	201065
Barcode Perm缓冲液	Fluidigm	201067
Cell-ID 20-Plex Pd条形码试剂盒	Fluidigm	201060
Cell-ID Intercalator-Ir	Fluidigm	201192A
EQ四元素校准微球	Fluidigm	201078
体内治疗	抗PD-1抗体	BioXcell	BE0146
抗TGF-β抗体	BioXcell	BE0057

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

DMEM培养基

胎牛血清

基质胶

Corning

356237

Western blot

牛血清白蛋白

Sigma-Aldrich

A4737

免疫组化

柠檬酸盐缓冲液

Sigma-Aldrich

C9999

蛋白提取

WB和IP裂解液

Yeasen

20118ES60

蛋白酶抑制剂混合物

Yeasen

20124ES03

磷酸酶抑制剂混合物

Yeasen

20109ES05

免疫共沉淀

Protein A + G 磁珠

MCE

HY-K0202

核糖核酸酶A/T1

Thermo Fisher

EN0551

细胞筛选

G418

Beyotime

ST081

RNA提取

TRIzol试剂

Thermo Fisher

15596026

qPCR

SYBR Green

Roche

04707516001

ELISA

TGFβ ELISA试剂盒

R&D Systems

DB100C

原代细胞分离

Liberase消化酶

Merck

05401020001

细胞培养

L-谷氨酰胺

Thermo Fisher

A2916801

药物处理

白三烯B4

Cayman

20110

JNK抑制剂

Aladdin

J125321

BLT2抑制剂

MCE

HY-15744

BLT1抑制剂

Cayman

70705

细胞裂解

ACK裂解液

Thermo Fisher

A1049201

细胞培养

巨噬细胞集落刺激因子

Novoprotein

CB34

白细胞介素-4

Novoprotein

CK74

脂多糖

Beyotime

S1732

干扰素-γ

Novoprotein

C746

细胞筛选

嘌呤霉素

Beyotime

ST551

免疫荧光

Hoechst 33342

Sigma-Aldrich

B2883

免疫组化

Opal Polaris 7色手动IHC检测试剂盒

Akoya

NEL86100KT

DAB过氧化物酶底物试剂盒

Beyotime

P0203

凋亡检测

TUNEL凋亡试剂盒

Beyotime

C1098

qPCR

逆转录试剂盒

Yeasen

11149ES

血清生化检测

ALT活性检测试剂盒

Nanjing Jiancheng

C009-2-1

AST活性检测试剂盒

Nanjing Jiancheng

C010-2-1

RNA测序

VAHTS总RNA测序文库制备试剂盒

Vazyme

NR603

核质分离

核质提取试剂盒

Yeasen

20126ES

RNA免疫沉淀

RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒

FITGENE

FI8707

染色质免疫沉淀

染色质提取试剂盒

Abcam

ab117152

一步法磁珠ChIP试剂盒

Abcam

ab156907

DNA纯化

PCR纯化试剂盒

Beyotime

D0033

ChIP测序

NEBNext Ultra DNA文库制备试剂盒

NEB

E7645L

细胞转染

jetPRIME体外DNA和siRNA转染试剂盒

Polyplus

101000027

质谱流式

顺铂

Fluidigm

201064

Fix I缓冲液

Fluidigm

201065

Barcode Perm缓冲液

Fluidigm

201067

Cell-ID 20-Plex Pd条形码试剂盒

Fluidigm

201060

Cell-ID Intercalator-Ir

Fluidigm

201192A

EQ四元素校准微球

Fluidigm

201078

体内治疗

抗PD-1抗体

BioXcell

BE0146

抗TGF-β抗体

BioXcell

BE0057

环节	核对要点
临床样本分析	TMA队列样本量133例；LTA4H免疫组化评分标准；CHCC-HBV队列样本量159例阅读提示：STAR Methods, Tissue microarray and patients, Figure 1
小鼠肝癌模型	小鼠品系及基因型；DEN给药剂量和途径；DEN+CCL4方案；肿瘤计数和肝脏重量阅读提示：STAR Methods, Mice and HCC mouse model, Figure 2
原代肝细胞实验	肝细胞分离方法；LTA4H敲除验证；JNK信号分子检测；LTB4和抑制剂处理浓度阅读提示：STAR Methods, Isolation and treatment of primary hepatocytes, Figure 3
巨噬细胞极化实验	BMDM分离和极化条件；共培养体系；TGF-β激活和中和处理阅读提示：STAR Methods, Isolation of BMDMs and coculture, Figure 5
免疫治疗实验	原位肿瘤模型构建；抗PD-1和抗TGF-β剂量及给药时间；生物发光成像时间点阅读提示：STAR Methods, Mice and HCC mouse model, Figure 7

环节

核对要点

临床样本分析

TMA队列样本量133例；LTA4H免疫组化评分标准；CHCC-HBV队列样本量159例

阅读提示：STAR Methods, Tissue microarray and patients, Figure 1

小鼠肝癌模型

小鼠品系及基因型；DEN给药剂量和途径；DEN+CCL4方案；肿瘤计数和肝脏重量

阅读提示：STAR Methods, Mice and HCC mouse model, Figure 2

原代肝细胞实验

肝细胞分离方法；LTA4H敲除验证；JNK信号分子检测；LTB4和抑制剂处理浓度

阅读提示：STAR Methods, Isolation and treatment of primary hepatocytes, Figure 3

巨噬细胞极化实验

BMDM分离和极化条件；共培养体系；TGF-β激活和中和处理

阅读提示：STAR Methods, Isolation of BMDMs and coculture, Figure 5

免疫治疗实验

原位肿瘤模型构建；抗PD-1和抗TGF-β剂量及给药时间；生物发光成像时间点

阅读提示：STAR Methods, Mice and HCC mouse model, Figure 7

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