DDC诱导MDBs小鼠模型建立及表型验证
建立MDBs小鼠模型，并验证MDBs形成及巨噬细胞浸润。
雄性C3H小鼠分为对照组、DDC-Fed组、DDC-Withdrawn组和DDC-Refed组，分别喂食标准饮食或添加0.1% DDC的饮食10周，然后撤除DDC 1个月，再重新喂食DDC 6-10天。通过H&E染色和F4/80免疫组化检测MDBs形成和巨噬细胞浸润。
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单细胞转录组分析揭示肝脏Mallory-Denk小体发病过程中巨噬细胞重编程的特征
Single-cell transcriptomic analysis reveals characteristic feature of macrophage reprogramming in liver Mallory-Denk bodies pathogenesis.
实验完整度
高包含snRNA-seq、体外细胞模型、共培养系统、动物模型及患者样本等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
C3H背景小鼠DDC诱导MDBs模型 Hepa1-6细胞MDB形成模型 Raw264.7巨噬细胞 HCC患者肝脏活检样本
重点核对
DDC喂养剂量（0.1% DDC）及喂养时间（10周） 小鼠品系（C3H）及性别（雄性） MDB形成细胞模型的细胞因子浓度（TNFα 40 ng/ml, IFNγ 400 ng/ml）及处理时间（10天） 接触和Transwell共培养系统中Raw264.7细胞的LPS激活条件（100 ng/ml LPS处理24小时） 患者样本中的MDBs存在性（通过组织学确认）
摘要
慢性肝病与线粒体功能障碍和巨噬细胞浸润高度相关。Mallory-Denk小体（MDBs）是与肝脏炎症相关的蛋白聚集体，通过给小鼠喂食3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡啶（DDC）可诱导MDBs的发病。在此，我们通过单核RNA测序（snRNA-seq）研究DDC诱导的MDBs小鼠模型中MDBs发病过程中的巨噬细胞异质性和巨噬细胞的作用。我们将肝脏巨噬细胞定义为四个不同的亚群，包括单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）亚群和三个Kupffer细胞（KCs）亚群（Gpnmbhigh KCs、Peam1high KCs和Gpnmblow Pecam1low KCs）。特别地，我们鉴定了一个新的Gpnmbhigh KCs亚群，作为脂质相关巨噬细胞（LAM），高表达Trem2、CD63和CD9。有趣的是，LAM在MDBs形成过程中通过表达抗炎基因IL-7R表现出潜在的免疫抑制特征。利用接触和Transwell共培养系统，发现肝细胞释放的mtDNA可诱导巨噬细胞中炎症小体的激活。此外，我们揭示了受损的DNA可以激活NOD样受体家族pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体，并随后形成含有caspase招募结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）斑点。总之，我们的结果首次揭示了MDBs发病过程中巨噬细胞的异质性和损伤肝脏释放的mtDNA激活的炎症小体，为慢性肝病的发病机制提供了重要理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在MDBs发病过程中，肝脏巨噬细胞呈现怎样的异质性，以及巨噬细胞如何被激活并参与MDBs的发病机制？
- 核心机制
- MDB形成过程中，受损肝细胞释放mtDNA，作为DAMPs激活巨噬细胞中的NLRP3炎症小体，导致ASC斑点形成和IL-1β分泌，从而促进炎症和MDBs形成。
- 主要证据
- 通过snRNA-seq鉴定出巨噬细胞亚群，特别是LAM亚群（表达Gpnmb、Trem2、IL-7R）；体外共培养实验证明肝细胞释放的mtDNA被巨噬细胞吞噬并激活NLRP3炎症小体；动物和患者样本中观察到8-OHdG与ASC斑点共定位。
- 研究意义
- 首次揭示MDBs发病过程中肝脏巨噬细胞的异质性及mtDNA激活炎症小体的机制，为理解慢性肝病发病机制提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单核RNA测序及巨噬细胞亚群鉴定
揭示MDBs发病过程中巨噬细胞的转录组异质性。
从小鼠肝脏分离细胞核，进行snRNA-seq（10× Genomics平台），通过Seurat进行聚类分析，鉴定巨噬细胞亚群并分析特征基因表达和通路富集。
体外MDB形成细胞模型的建立
建立MDB形成的细胞模型，用于后续研究巨噬细胞与肝细胞的相互作用。
Hepa1-6细胞用TNFα和IFNγ持续刺激10天，通过免疫荧光和qPCR验证MDB形成（蛋白聚集体和免疫蛋白酶体基因表达）。
接触共培养验证巨噬细胞吞噬受损肝细胞释放的mtDNA
验证巨噬细胞是否吞噬MDB形成肝细胞释放的mtDNA。
将MDB-forming hepa1-6细胞用MitoTracker标记后与Raw264.7细胞共培养，通过免疫荧光检测F4/80阳性细胞中MitoTracker信号。
Transwell共培养验证炎症小体激活
验证MDB形成肝细胞释放的DAMPs能否激活巨噬细胞NLRP3炎症小体。
将MDB-forming hepa1-6细胞置于Transwell上室，与下室的Raw264.7细胞共培养，部分Raw264.7细胞先用LPS预处理，通过qPCR和ELISA检测炎症因子表达。
体内验证NLRP3炎症小体激活
在动物模型中验证MDBs形成过程中NLRP3炎症小体的激活。
通过qPCR、Western blot和ELISA检测肝组织中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的表达，并通过免疫荧光观察8-OHdG与ASC斑点共定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | 3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡啶 | Sigma-Aldrich | 137030-25G |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| 胎牛血清 | Excell | FSS500 | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| MDBs诱导（细胞因子） | 肿瘤坏死因子α | PeproTech | 315-01A |
| 干扰素γ | novoprotein | C746 | |
| 细胞共培养（线粒体标记） | MitoTracker线粒体探针 | Invitrogen | M7512 |
| 细胞共培养（LPS刺激） | 脂多糖 | Sigma | L2630 |
| 免疫染色（DAPI） | DAPI染液 | Beyotime | c1002 |
| 免疫荧光（封片剂） | 抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | P0128M |
| 免疫组化（抗原修复） | 柠檬酸抗原修复液 | Beyotime | P0081 |
| 免疫组化（DAB显色） | DAB显色试剂盒 | ZSGB-Bio | ZLI-9018 |
| 免疫荧光（组织自发荧光淬灭） | 组织自发荧光淬灭剂 | Servicebio | G1221 |
| 透射电镜（固定） | 锇酸 | -- | -- |
| 透射电镜（包埋） | Epon-Araldite树脂 | Ted Pella Inc | -- |
| 透射电镜 | Leica EM UC7超薄切片机 | Leica | LeicaUC7 |
| JEM1400透射电子显微镜 | JEOL | JEM1400 | |
| Western blot（蛋白裂解） | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| Western blot（蛋白酶抑制剂） | 蛋白酶抑制剂混合物I | Apexbio | K1007 |
| Western blot（膜） | PVDF膜 | Millipore | ISEQ00010 |
| Western blot（抗体） | 抗NLRP3兔单克隆抗体 | Abcam | EPR23094-1 |
| 抗ASC兔单克隆抗体 | -- | -- | |
| 抗Pro-Caspase-1兔单克隆抗体 | MCE | HY-P80587 | |
| 抗Cleaved-Caspase-1兔单克隆抗体 | MCE | HY-P80622 | |
| 抗IL-1β兔单克隆抗体 | Abclonal | A16288 | |
| 抗β-actin小鼠单克隆抗体 | Proteintech | HRP-66009 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Beyotime | AT-819-1 | |
| 抗GAPDH小鼠单克隆抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 免疫组化（抗体） | 小鼠抗F4/80抗体 | Bioss | bsm-34028M |
| 兔抗IL-7R抗体 | Bioss | bs-1540R | |
| 免疫荧光（抗体） | 兔抗GPNMB抗体 | Bioss | bs-2684R |
| 兔抗8-OHdG抗体 | Bioss | bs-1278R | |
| 兔抗ASC抗体 | CST | 67824 | |
| 兔抗KRT8抗体 | Abcam | ab55407 | |
| 小鼠抗核孔蛋白p62抗体 | Santacruz | sc-48373 | |
| 免疫荧光（二抗） | Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG | Invitrogen | A11008 |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG | Invitrogen | A21428 | |
| Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa Fluor 647驴抗兔IgG | Invitrogen | A31573 | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Thermo | 88-7013A-88 |
| qPCR（RNA提取） | 细胞/组织总RNA提取试剂盒 | Yeason | 19221ES50 |
| qPCR（逆转录） | 5×HiScript III qRT SuperMix逆转录预混液 | Vazyme | R323-01 |
| qPCR（反应） | TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A |
| 设备（全自动扫描） | PRECICE 500玻片扫描仪 | UNIC | -- |
| 设备（激光共聚焦） | LSM880激光共聚焦显微镜 | ZEISS | -- |
| 设备（ELISA读数） | VARIOSKAN FLASH多功能酶标仪 | Thermo | -- |
| 设备（发光成像） | Pxi9化学发光成像系统 | Syngene | -- |
| 细胞培养（耗材） | 12孔腔室载玻片 | CITOTEST | -- |
| Transwell共培养（耗材） | Transwell-24插入式培养皿 | Nest | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系（C3H）、性别（雄性）、DDC浓度（0.1%）、喂养时长（10周）、撤除时长（1个月）、再喂养时长（6-10天）、每组样本量（n=3） 阅读提示：Methods - Animal experiments |
| 单核RNA测序 | 细胞核分离方法、10× Genomics平台、数据分析流程（Seurat、UMAP、Wilcoxon、KEGG、GSVA） 阅读提示：Methods - Single-nucleus RNA-Sequencing (snRNA-seq) and bioinformatics |
| 体外MDB模型 | Hepa1-6细胞系、TNFα浓度（40 ng/ml）、IFNγ浓度（400 ng/ml）、处理时长（10天）、细胞因子更换间隔（每3天） 阅读提示：Methods - MDBs induction in vitro |
| 共培养实验 | Raw264.7和Hepa1-6细胞系、共培养方式（接触或Transwell）、共培养时间（24小时）、细胞比例（1:1）、LPS预处理浓度（100 ng/ml）和时长（24小时） 阅读提示：Methods - Raw264.7/Hepa1-6 contact co-culture and mitochondrial labelling and Raw264.7/Hepa1-6 Transwell coculture system |
| 分子检测 | 抗体品牌和货号（如anti-NLRP3 Abcam EPR23094-1）、qPCR引物序列、ELISA试剂盒品牌（Thermo 88-7013A-88） 阅读提示：Methods - Western blot, Immunofluorescence, and ELISA |