建立急性肝损伤模型并检测β-catenin表达
确定β-catenin在急性肝损伤中的表达变化及其细胞定位。
对小鼠腹腔注射APAP或D-GalN/LPS诱导急性肝损伤，检测肝组织中β-catenin mRNA和蛋白水平、磷酸化状态，以及不同巨噬细胞亚群中的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
β-Catenin缺失降低巨噬细胞外泌体α-SNAP并阻碍急性肝损伤中Treg分化
β-Catenin disruption decreases macrophage exosomal α-SNAP and impedes Treg differentiation in acute liver injury.
实验完整度
高包含体内动物模型（APAP和D-GalN/LPS诱导的肝损伤）、体外共培养实验、外泌体功能验证及机制验证（质谱蛋白质组学、过表达实验）。
主要模型
小鼠急性肝损伤模型（APAP诱导） 小鼠急性肝损伤模型（D-GalN/LPS诱导） 骨髓来源巨噬细胞（BMDM）与naive CD4+ T细胞共培养 RAW264.7巨噬细胞
重点核对
APAP剂量：300 mg/kg体重，腹腔注射，禁食14小时后给药，24小时后取材 D-GalN/LPS剂量：600 mg/kg D-GalN + 30 μg/kg LPS，腹腔注射，5小时后取材 骨髓来源巨噬细胞（BMDM）分离与LPS刺激条件（500 ng/mL，6小时） 共培养条件：naive CD4+ T细胞与BMDM或外泌体（30 μg/mL）共培养3天，加入anti-CD3 (1 μg/mL)、anti-CD28 (1 μg/mL)和IL-2 (5 μg/mL或5 ng/mL) 外泌体分离：差速超速离心（100,000g，70分钟），并验证标志物TSG101、CD9、CD63
摘要
肝巨噬细胞和调节性T细胞（Tregs）在维持肝脏免疫稳态中发挥重要作用，但肝巨噬细胞在急性肝损伤中调节Tregs的机制仍 largely 未知。在此，我们发现肝Treg比例和肝巨噬细胞中β-catenin的表达与对乙酰氨基酚和D-半乳糖胺/LPS诱导的急性肝损伤相关。有趣的是，β-catenin仅在浸润性巨噬细胞中显著上调，而非在常驻库普弗细胞中。髓系特异性β-catenin敲除小鼠表现出增加的炎症细胞浸润和肝细胞凋亡。此外，髓系β-catenin缺失降低了损伤肝脏中的肝Treg比例。机制上，体外共培养实验揭示巨噬细胞β-catenin调节其外泌体组成并影响Treg分化。通过基于质谱的蛋白质组学，我们鉴定出巨噬细胞β-catenin激活增加了外泌体α-SNAP的水平，进而促进Treg分化。总之，我们的发现揭示了巨噬细胞β-catenin通过增强外泌体α-SNAP的表达来调节肝脏中Treg比例的分子机制，为急性肝损伤的病理生理学提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在急性肝损伤中，肝巨噬细胞如何调节Treg分化？
- 核心机制
- 巨噬细胞β-catenin激活通过上调外泌体中α-SNAP的水平，进而促进Treg分化。
- 主要证据
- 使用髓系特异性β-catenin敲除小鼠模型、BMDM与T细胞共培养、外泌体功能实验及质谱蛋白质组学，证明β-catenin缺失下调外泌体α-SNAP并阻碍Treg分化。
- 研究意义
- 揭示巨噬细胞β-catenin在急性肝损伤病理生理中的新机制，为靶向巨噬细胞β-catenin的治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证髓系β-catenin缺陷对肝损伤和Treg比例的影响
评估髓系β-catenin缺失在体内对肝损伤严重程度和Treg比例的作用。
使用β-cateninM-KO和β-cateninfl/fl小鼠，建立APAP和D-GalN/LPS肝损伤模型，检测血清ALT/AST、肝组织病理、凋亡、炎症细胞浸润和Treg比例。
体外共培养验证巨噬细胞β-catenin对Treg分化的影响
在体外直接检测巨噬细胞β-catenin对naive CD4+ T细胞向Treg分化的调节作用。
分离BMDM，用siRNA或基因敲除降低β-catenin，与naive CD4+ T细胞共培养，检测Foxp3+ Treg比例和IL-10水平。
验证外泌体介导的细胞间通讯
证明巨噬细胞通过外泌体传递信号调节Treg分化。
用GW4869抑制外泌体释放，观察Treg比例变化；分离并表征BMDM外泌体，验证其被T细胞摄取，并检测外泌体对Treg分化的影响。
鉴定并验证外泌体关键蛋白α-SNAP
识别巨噬细胞β-catenin调控的外泌体蛋白，并验证其功能。
使用LC/MS蛋白质组学比较β-cateninfl/fl和β-cateninM-KO BMDM外泌体蛋白差异，筛选出α-SNAP；通过过表达α-SNAP进行功能验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 急性肝损伤模型 | 对乙酰氨基酚 | -- | -- |
| D-半乳糖胺 | -- | -- | |
| 脂多糖 | -- | -- | |
| 细胞培养与处理 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | Meiluncell | MA0548 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L929条件培养基 | -- | -- | |
| 细胞因子和抗体 | 抗CD3抗体 | BioLegend | 100340 |
| 抗CD28抗体 | BioLegend | 102116 | |
| 重组小鼠IL-2 | PeproTech | 212-12 | |
| 外泌体抑制剂 | GW4869 | MilliporeSigma | D1692 |
| 外泌体标记 | PKH26 | MilliporeSigma | MINI26 |
| 流式分析 | FACSAria III流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FITC抗CD3 | eBioscience | 11-0032-82 | |
| APC抗CD4 | eBioscience | 17-0041-82 | |
| PE-Cy7抗CD25 | eBioscience | 25-0251082 | |
| PE抗Foxp3 | eBioscience | 12-4771-82 | |
| FITC抗CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| PE-Cy7抗F4/80 | BioLegend | 123114 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| β-catenin抗体 | ABclonal | A19657 | |
| β-tubulin抗体 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| GAPDH抗体 | ABclonal | AC001 | |
| 磷酸化β-catenin (Ser552)抗体 | Cell Signaling Technology | 5651 | |
| β-Actin抗体 | ABclonal | AC038 | |
| 外泌体标志物 | TSG101抗体 | Abcam | ab125011 |
| CD9抗体 | ABclonal | A19027 | |
| CD63抗体 | Abcam | ab217345 | |
| 免疫印迹 | α-SNAP抗体 | Invitrogen | MA5-36194 |
| NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L) | ABclonal | AS014 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L) | ABclonal | AS003 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- | |
| Hieff qPCR SYBR Green预混液 | YEASEN | -- | |
| CFX 96检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞分离 | EasySep小鼠naive CD4+ T细胞分离试剂盒 | Stem Cell Technologies | -- |
| 细胞转染 | pCMV-α-SNAP质粒 | MIAOLING Biology | -- |
| Lipo8000转染试剂 | Beyotime | C0533 | |
| β-catenin siRNA | GenePharma | -- | |
| 外泌体分离与表征 | HT7700透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 纳米颗粒跟踪分析仪 | Particle Metrix | -- | |
| LC/MS分析 | Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1200系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ELISA | IL-10 ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00016 |
| 组织学 | CD11b抗体 | Abcam | ab133357 |
| MPO抗体 | Cell Signaling Technology | 14569S | |
| cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662S | |
| 生物素化山羊抗兔IgG | SeraCare | 5220-0336 | |
| CD68抗体 | Abcam | ab125212 | |
| β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 8480 | |
| CD11b抗体 | Beyotime | AF6396 | |
| 活性β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 8814 | |
| 山羊抗兔IgG/APC | Bioss | bs-0295G-APC | |
| TUNEL | 凋亡检测试剂盒 | EMD Millipore | S7110 |
| 生化分析 | Olympus全自动生化分析仪AU5400 | Olympus | -- |
| 统计软件 | Prism 7.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 急性肝损伤模型 | APAP剂量300 mg/kg，腹腔注射，禁食14小时，24小时取材；D-GalN/LPS剂量600 mg/kg和30 μg/kg，腹腔注射，5小时取材；小鼠品系（β-cateninfl/fl和β-cateninM-KO，6-8周龄，雄性） 阅读提示：见Methods：Mouse acute liver injury model和Animals |
| 细胞共培养 | BMDM的分离与培养（LPS 500 ng/mL刺激6小时）；naive CD4+ T细胞纯度>90%；共培养比例1:1，加入anti-CD3 (1 μg/mL)、anti-CD28 (1 μg/mL)、IL-2 (5 μg/mL)，培养3天 阅读提示：见Methods：Isolation of BMDMs and naive CD4+ T cells和Cell culture and coculture system |
| 外泌体分离和功能 | 外泌体分离的离心参数（300g 10min, 2000g 10min, 10000g 30min, 100000g 70min）；外泌体浓度30 μg/mL用于与T细胞共培养；PKH26标记外泌体与T细胞共培养8小时 阅读提示：见Methods：Isolation and characterization of BMDM exosomes和Exosome labeling for cellular uptake |
| 机制验证 | α-SNAP过表达（pCMV-α-SNAP质粒转染RAW264.7或β-cateninM-KO BMDM）；siRNA序列；NF-κB p65表达检测 阅读提示：见Methods：Plasmid and siRNA和In vitro transfection，及Results相应部分 |
| 数据分析 | 统计方法采用2-tailed Student's t test或1-way ANOVA；数据以mean ± SD表示；P<0.05认为显著 阅读提示：见Methods：Statistics |