样本收集和多组学测序
获取HCC、肝硬化和对照组织的多组学数据，构建全局异质性景观
收集手术组织样本和血液样本，进行scRNA-seq、ST-seq、全外显子测序、全转录组测序、全长转录组测序、蛋白质组和代谢组测序
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单细胞-空间转录组学与批量多组学分析肝细胞癌的异质性和生态系统
Single cell-spatial transcriptomics and bulk multi-omics analysis of heterogeneity and ecosystems in hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高包含scRNA-seq、ST-seq及批量多组学分析，并通过IHC验证快速复发标志物，多层级实验证据。
主要模型
HCC组织样本（6例） 肝硬化组织样本（1例） 非癌肝组织对照（1例） HCC细胞系（未提及，但主要基于临床样本）
重点核对
样本来源：6例HCC患者和1例对照供体，需确认病理诊断和临床分期 分组：快速复发（DFS≤2个月）与无复发患者，样本量32例和9例 检测方法：scRNA-seq、ST-seq、全外显子测序、全转录组测序、全长转录组测序、蛋白质组、非靶向代谢组 关键基因：KRT8、KRT18、KRT20的表达水平（免疫组化验证） 统计设计：P值（如KRT8 P=0.0272）需核对
摘要
本研究绘制了来自6例肝细胞癌（HCC）病例和1例非癌肝对照供体的全球单细胞-空间-批量转录组景观。我们发现瘤内异质性主要来源于HCC细胞的多样性，并遍及基因组-转录组-蛋白质组-代谢组网络。HCC细胞是驯化肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）使其呈现促肿瘤表型以利于其优势生长的核心驱动力。值得注意的是，M1型TAMs以代谢紊乱、抗原呈递和免疫杀伤能力差为特征。此外，我们发现在同一个体患者中同时存在的肝硬化和HCC病变具有共同起源，并通过驱动不同的免疫重编程表现出平行克隆进化以适应环境。此外，内皮细胞表现出表型保守，但以空间依赖的方式执行不同的功能。进一步，我们通过免疫组化鉴定并验证了快速复发生态位基因的时空特征。我们的数据揭示了HCC细胞在塑造与临床情景相对应的动态肿瘤生态系统中的重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HCC的瘤内异质性如何产生，以及肿瘤生态系统在时空上是如何动态演化的？
- 核心机制
- HCC细胞通过代谢重编程和免疫抑制性配体-受体相互作用（如CD86-CTLA4、HAVCR2-LGALS9）驯化巨噬细胞和T细胞，塑造免疫抑制微环境
- 主要证据
- 通过单细胞和空间转录组分析发现M1-TAMs表现为代谢异常和免疫杀伤能力受损，以及通过IHC验证KRT8/18/20在快速复发患者中高表达
- 研究意义
- 揭示了HCC细胞在塑造肿瘤生态系统中的核心作用，为个体化精准诊疗策略的制定提供资源
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞和空间转录组数据分析
鉴定细胞类型和空间分布，评估瘤内异质性
使用Seurat进行聚类和注释，使用CopyKAT估计CNV，使用stlearn进行空间轨迹推断
免疫微环境分析
探讨HCC细胞与免疫细胞的相互作用及其机制
分析巨噬细胞和CD8+ T细胞亚群，构建细胞通讯网络，并验证配体-受体共定位
进化轨迹分析
揭示肝硬化和HCC的共同起源和分化路径
对肝硬化- HCC样本进行伪时间分析和空间轨迹分析，识别共享祖细胞和差异基因模块
血管生态位分析
研究内皮细胞的异质性和血管生成机制
分析内皮细胞亚群，评估血管生成相关信号通路和转录因子，并构建血管生成评分
快速复发生态位鉴定与验证
识别快速复发相关基因并验证其表达
比较快速复发患者与无复发患者的基因表达，通过IHC验证KRT8/18/20表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | CRP抗体 | Bioss | bs-0155R |
| LGALS4抗体 | Abways | CY7043 | |
| NPW抗体 | Bioss | bs-11531R | |
| IFI27抗体 | Affinity | DF8989 | |
| CYP2E1抗体 | Bioss | bs-4562R | |
| SAA1抗体 | Bioss | bs-19359R | |
| CA4抗体 | R&D Systems | MAB2186-SP | |
| IDO1抗体 | Bioss | bs-15493R | |
| HOXD9抗体 | Bioss | bs-8603R | |
| ANGPT2抗体 | Bioss | bs-0677R | |
| FLT1抗体 | Bioss | bs-0170R | |
| KRT8抗体 | Bioss | bsm-52419R | |
| KRT18抗体 | Bioss | bs-2043R | |
| KRT20抗体 | Bioss | bsm-52060R | |
| 马抗小鼠/兔IgG | Vector | ZF1028 | |
| 空间转录组测序 | Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
| 单细胞RNA测序 | 10× Genomics单细胞3'v3.1试剂盒 | 10× Genomics | PN-1000269 |
| 全外显子测序 | Nimblegen Seqcap Ez外显子富集试剂盒V3 | Nimblegen | -- |
| 全转录组测序 | Trizol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Ribo-Zero rRNA去除试剂盒 | Epicentre | RZH1046 | |
| NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | -- | |
| 全长转录组测序 | cDNA PCR测序试剂盒（SQK-PCS109） | Oxford Nanopore | SQK-PCS109 |
| 蛋白质组测序 | Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| 代谢组测序 | Acquity UPLC HSS T3色谱柱 | Waters | 186003538 |
| Xevo G2-XS QTOF质谱仪 | Waters | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 患者来源、病理诊断、病变类型（HCC/肝硬化）、对照样本 阅读提示：Methods - Human subject |
| 多组学测序 | 测序平台、文库制备试剂盒、质控标准（如RIN值） 阅读提示：Methods - 空间转录组测序、单细胞RNA测序、全外显子测序、全转录组测序、全长转录组测序、蛋白质组测序、代谢组测序 |
| 免疫组化验证 | 抗体克隆号、稀释比例（未明确）、染色流程 阅读提示：Methods - 免疫组织化学染色 |
| 数据分析 | 聚类参数、标记基因、CNV方法、伪时间分析参数、通讯分析数据库 阅读提示：Methods - 单细胞图谱生成、空间转录组图谱生成、CNV估计、通路富集、拟时间分析、细胞通讯分析 |