分离和鉴定原代大鼠子宫内膜细胞
获取并验证原代子宫内膜细胞的纯度和特性。
从大鼠子宫分离原代子宫内膜细胞,通过密度梯度离心和流式细胞术检测CK-18和vimentin的表达。
A Preliminary Investigation of the Roles of Endometrial Cells in Endometriosis Development via In Vitro and In Vivo Analyses.
包含体外细胞实验(LPS刺激原代EC检测蛋白和mRNA)和两种体内大鼠模型(腹腔和腹膜移植),并通过IHC和qPCR进行功能验证。
大鼠原代子宫内膜细胞 腹膜腔异位子宫内膜异位症样病变大鼠模型 腹膜异位子宫内膜异位症样病变大鼠模型
LPS刺激浓度:100 ng/mL,刺激时间48小时 雌激素剂量:2.5 mg/kg/day,持续4周 两种造模方式:子宫组织匀浆分散至腹膜腔(供体:受体=1:2)和子宫片段缝合至腹膜 检测时间点:术后第28天
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取并验证原代子宫内膜细胞的纯度和特性。
从大鼠子宫分离原代子宫内膜细胞,通过密度梯度离心和流式细胞术检测CK-18和vimentin的表达。
研究LPS对原代子宫内膜细胞增殖、炎症和纤维化相关基因和蛋白表达的影响。
用100 ng/mL LPS刺激原代EC 48小时,通过western blot和RT-qPCR检测Ki-67、TGF-β、NF-κB、fibronectin、vimentin和VEGF的表达。
建立并比较两种不同移植方法(腹膜腔分散和腹膜缝合)的异位子宫内膜异位症大鼠模型。
通过子宫组织匀浆腹腔注射(Procedure 1)和子宫片段缝合到腹膜(Procedure 2)建立模型,并给予雌激素或生理盐水持续4周。
评估两种模型中异位病变的囊肿大小、蛋白表达和基因表达。
在术后第28天处死大鼠,观察并测量囊肿大小,通过IHC检测CK-18、VEGF、TGF-β和TNF-α的蛋白表达,通过qPCR检测相应基因表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基/F-12 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10437028 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030-081 | |
| 细胞分离 | 胶原酶 | Nordmark | S1746501 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L2630 |
| 动物实验 | 17β-雌二醇 | Sigma | E1024 |
| 流式分析 | CK-18抗体 | BIOSS | bs-2043R-A488 |
| Vimentin抗体 | Abcam | ab92547 | |
| Western blot | Ki-67抗体 | Sigma-Aldrich | SAB5700770 |
| TGF-β抗体 | Cell Signaling Technology | 3711 | |
| NF-κB抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 磷酸化NF-κB抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 纤连蛋白抗体 | BIOSS | bs-006R | |
| VEGF抗体 | GeneTex | GTX102643 | |
| GAPDH抗体 | Invitrogen | MA5-15738 | |
| RIPA裂解缓冲液 | T-Pro Biotechnology | JT | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH85R | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | WBKLS0500 | |
| RNA提取 | Quick-RNA小提试剂盒 | Zymo Research | -- |
| qPCR | Fast SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- |
| ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫组化 | TGF-β抗体 | BIOSS | bs-4538R |
| DAKO REAL EnVision检测系统 | DAKO | K5007 | |
| CC/Mount封片剂 | Sigma-Aldrich | C9368 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 大鼠品系和年龄:SD大鼠,7-8周龄;体重200-250g;激素剂量:2.5 mg/kg/day,持续4周 阅读提示:见材料与方法4.1和4.5 |
| 细胞培养与刺激 | LPS浓度:100 ng/mL,刺激时间48小时;细胞密度:5×10^5细胞/10-cm皿 阅读提示:见材料与方法4.4 |
| 分子检测 | qPCR内参基因β-actin;Western blot蛋白上样量10 μg 阅读提示:见材料与方法4.6和4.7 |
| 免疫组化分析 | 抗体信息:TGF-β (bs-4538R);抗原修复:柠檬酸盐缓冲液pH 6.0 阅读提示:见材料与方法4.8 |