通过体外和体内分析初步研究子宫内膜细胞在子宫内膜异位症发展中的作用

A Preliminary Investigation of the Roles of Endometrial Cells in Endometriosis Development via In Vitro and In Vivo Analyses.

作者信息Yin-Hua Cheng, Ching-Wei Huang, Hao-Ting Lien, Yu-Yang Hsiao, Pei-Ling Weng, Yung-Chiao Chang, Jai-Hong Cheng, Kuo-Chung Lan
PMID38612685
发布时间2024-03-30
DOI10.3390/ijms25073873

实验完整度

高

包含体外细胞实验(LPS刺激原代EC检测蛋白和mRNA)和两种体内大鼠模型(腹腔和腹膜移植),并通过IHC和qPCR进行功能验证。

主要模型

大鼠原代子宫内膜细胞 腹膜腔异位子宫内膜异位症样病变大鼠模型 腹膜异位子宫内膜异位症样病变大鼠模型

重点核对

LPS刺激浓度:100 ng/mL,刺激时间48小时 雌激素剂量:2.5 mg/kg/day,持续4周 两种造模方式:子宫组织匀浆分散至腹膜腔(供体:受体=1:2)和子宫片段缝合至腹膜 检测时间点:术后第28天

摘要

子宫内膜异位症是一种复杂的妇科疾病,影响超过10%的育龄期女性。虽然手术可以暂时缓解女性的疼痛,但症状在两年内复发的比例高达75%。既往文献对子宫内膜异位症的发展提出了一些理论,但其确切的发病机制和病因仍不清楚。我们初步研究了原代子宫内膜细胞(ECs)对子宫内膜异位症发生发展的影响。在体外研究中,用脂多糖(LPS)诱导大鼠分离的原代子宫内膜细胞,结果导致核因子-κB(NF-κB)和血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA基因表达(定量聚合酶链反应分析,qPCR)和蛋白表达(western blot分析)增加。此外,体内研究利用自体及异体移植(大鼠到大鼠)来研究子宫内膜异位症样病变囊肿大小、体重、蛋白水平(免疫组织化学)和mRNA基因表达。这些研究表明,雌激素上调细胞骨架(CK)-18、转化生长因子-β(TGF-β)、VEGF和肿瘤坏死因子(TNF)-α的基因和蛋白调控,尤其是在腹膜中。这些发现可能影响细胞增殖、血管生成、纤维化和炎症标志物。因此,这可能加剧子宫内膜异位症的发生和进展。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
子宫内膜细胞在子宫内膜异位症发生发展中的作用及其机制,以及体内不同模型间的差异。
核心机制
LPS通过上调NF-κB和VEGF表达促进炎症和血管生成;雌激素上调腹膜中CK-18、TGF-β、VEGF和TNF-α的表达,可能影响细胞增殖、血管生成、纤维化和炎症。
主要证据
体外实验中LPS诱导原代EC后NF-κB和VEGF的mRNA及蛋白水平显著升高;体内两种大鼠模型中,雌激素注射后腹膜病变中CK-18、TGF-β、VEGF、TNF-α的蛋白和mRNA表达显著高于对照组。
研究意义
研究为理解雌激素在异位子宫内膜异位症中的作用提供初步依据,并可能为未来研究特定细胞类型(如巨噬细胞和树突状细胞)及潜在治疗靶点奠定基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

分离和鉴定原代大鼠子宫内膜细胞

获取并验证原代子宫内膜细胞的纯度和特性。

从大鼠子宫分离原代子宫内膜细胞,通过密度梯度离心和流式细胞术检测CK-18和vimentin的表达。

2

LPS刺激体外细胞实验

研究LPS对原代子宫内膜细胞增殖、炎症和纤维化相关基因和蛋白表达的影响。

用100 ng/mL LPS刺激原代EC 48小时,通过western blot和RT-qPCR检测Ki-67、TGF-β、NF-κB、fibronectin、vimentin和VEGF的表达。

3

建立两种大鼠异位子宫内膜异位症模型

建立并比较两种不同移植方法(腹膜腔分散和腹膜缝合)的异位子宫内膜异位症大鼠模型。

通过子宫组织匀浆腹腔注射(Procedure 1)和子宫片段缝合到腹膜(Procedure 2)建立模型,并给予雌激素或生理盐水持续4周。

4

评估病变特征和免疫组化分析

评估两种模型中异位病变的囊肿大小、蛋白表达和基因表达。

在术后第28天处死大鼠,观察并测量囊肿大小,通过IHC检测CK-18、VEGF、TGF-β和TNF-α的蛋白表达,通过qPCR检测相应基因表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
数据分析与统计

产品清单

实验环节名称品牌货号
杜尔贝科改良伊格尔培养基/F-12Thermo Fisher Scientific--
胎牛血清Invitrogen10437028
青霉素/链霉素Invitrogen15140-122
L-谷氨酰胺Invitrogen25030-081
胶原酶NordmarkS1746501
胰蛋白酶-EDTAInvitrogen25200-072
脂多糖Sigma-AldrichL2630
17β-雌二醇SigmaE1024
CK-18抗体BIOSSbs-2043R-A488
Vimentin抗体Abcamab92547
Ki-67抗体Sigma-AldrichSAB5700770
TGF-β抗体Cell Signaling Technology3711
NF-κB抗体Cell Signaling Technology8242
磷酸化NF-κB抗体Cell Signaling Technology3033
纤连蛋白抗体BIOSSbs-006R
VEGF抗体GeneTexGTX102643
GAPDH抗体InvitrogenMA5-15738
RIPA裂解缓冲液T-Pro BiotechnologyJT
PVDF膜MilliporeIPVH85R
辣根过氧化物酶标记二抗Sigma-AldrichA0545
Immobilon Western化学发光HRP底物MilliporeWBKLS0500
Quick-RNA小提试剂盒Zymo Research--
Fast SYBR Green预混液Applied Biosystems--
ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
TGF-β抗体BIOSSbs-4538R
DAKO REAL EnVision检测系统DAKOK5007
CC/Mount封片剂Sigma-AldrichC9368

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
大鼠品系和年龄:SD大鼠,7-8周龄;体重200-250g;激素剂量:2.5 mg/kg/day,持续4周
阅读提示:见材料与方法4.1和4.5
细胞培养与刺激
LPS浓度:100 ng/mL,刺激时间48小时;细胞密度:5×10^5细胞/10-cm皿
阅读提示:见材料与方法4.4
分子检测
qPCR内参基因β-actin;Western blot蛋白上样量10 μg
阅读提示:见材料与方法4.6和4.7
免疫组化分析
抗体信息:TGF-β (bs-4538R);抗原修复:柠檬酸盐缓冲液pH 6.0
阅读提示:见材料与方法4.8