去甲肾上腺素通过α2A-肾上腺素能受体保护耳蜗外毛细胞损伤和噪声性听力损失

Norepinephrine protects against cochlear outer hair cell damage and noise-induced hearing loss via α2A-adrenergic receptor.

作者信息Chaoyong Tian, Yang Yang, Renfeng Wang, Yao Li, Fei Sun, Jun Chen, Dingjun Zha
PMID38291397
发布时间2024-01-30
DOI10.1186/s12868-024-00845-4

实验完整度

包含体内SCGx大鼠模型结合ABR、DPOAE和免疫荧光验证,以及体外HEI-OC1细胞氧化应激、CCK-8、流式细胞术和Western blot功能与机制验证。

主要模型

Sprague-Dawley大鼠(SCGx模型) HEI-OC1细胞系

重点核对

SCGx手术的有效性(通过Horner's综合征确认) 噪声暴露参数:4 kHz倍频带噪声,115 dB SPL,每天6小时,连续2天 H2O2浓度(0.2-0.8 mM)和NE浓度(0.1-50 µM)及处理时间 α2A-AR在耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元中的表达

摘要

背景:耳蜗交感神经系统在听觉功能和噪声性听力损失(NIHL)的易感性中起着关键作用。活性氧(ROS)的形成是NIHL中一个充分记录的过程。在本研究中,我们旨在探讨上颈交感神经节切除术(SCGx)对Sprague-Dawley大鼠NIHL的影响。方法:我们探讨了单侧和双侧上颈交感神经节(SCG)消融对8-10周龄两性Sprague-Dawley大鼠NIHL的影响。通过听性脑干反应(ABR)测试和畸变产物耳声发射(DPOAEs)评估听觉功能。使用免疫荧光分析计数大鼠耳蜗中的外毛细胞(OHCs)和α2A-肾上腺素能受体(AR)的表达。细胞培养和处理、CCK-8测定、流式细胞术染色和分析以及蛋白质印迹法旨在探讨SCG纤维可能在NIHL中起保护作用的机制。结果:我们发现双侧或单侧SCGx均不能保护耳蜗免受噪声暴露。在HEI-OC1细胞中,应用去甲肾上腺素(NE)抑制了H2O2诱导的氧化损伤和细胞死亡。NE可能通过α2A-AR预防ROS诱导的OHCs氧化应激和NIHL。结论:这些结果表明,交感神经支配通过α2A-AR减少OHCs的氧化损伤,轻度影响耳蜗对声创伤的易感性。NE可能是预防NIHL的潜在治疗策略。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
交感神经系统(通过SCGx去除)是否影响噪声性听力损失,以及去甲肾上腺素是否通过α2A-AR保护外毛细胞免受氧化应激损伤?
核心机制
去甲肾上腺素通过激活α2A-AR抑制ROS诱导的氧化应激,从而保护外毛细胞损伤和NIHL。
主要证据
SCGx不影响噪声暴露后的ABR阈值和DPOAE幅度;在HEI-OC1细胞中,NE处理提高了H2O2暴露后的细胞活力并降低了凋亡;噪声暴露后α2A-AR表达上调。
研究意义
研究为理解肾上腺素能系统在NIHL中的作用提供了理论基础,并提示NE可能作为预防NIHL的潜在治疗策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

SCGx手术及效果确认

建立去除交感神经支配的大鼠模型,并验证手术成功。

对Sprague-Dawley大鼠进行双侧、单侧SCG切除或假手术,通过观察Horner's综合征确认手术成功。

2

噪声暴露及听觉功能评估

评估SCGx对噪声暴露后听觉功能的影响。

术后恢复两周后,大鼠接受噪声暴露,并在暴露后1小时、3天、7天、14天测量ABR和DPOAE。

3

形态学分析外毛细胞损失

检测SCGx和噪声暴露对外毛细胞存活的影响。

噪声暴露后14天,取耳蜗进行免疫荧光染色,计数外毛细胞损失。

4

体外氧化应激模型建立

建立HEI-OC1细胞氧化应激模型,模拟噪声诱导的ROS损伤。

用不同浓度的H2O2处理HEI-OC1细胞不同时间,评估细胞活力。

5

NE保护作用评估

验证NE对H2O2诱导的细胞损伤的保护作用。

用NE和H2O2共处理HEI-OC1细胞,通过CCK-8和流式细胞术检测细胞活力和凋亡。

6

受体表达分析

鉴定参与NE保护作用的肾上腺素能受体亚型。

通过Western blot检测噪声暴露和对照组耳蜗中九种AR亚型的表达变化,并通过免疫荧光定位α2A-AR和DBH。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
鬼笔环肽Cytoskeleton, Inc.PHDR1
DAPISolarbio Corporation--
Hoechst 33342Yeasen--
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-50G
抗α2A-AR抗体abcamab85570
抗DBH抗体Affinity BiosciencesDF7060
抗β3抗体MilliporeMAB1637
Alexa 488标记的驴抗兔二抗Thermo FisherA-21206
Alexa 594标记的山羊抗小鼠二抗Thermo FisherA11005
DMEM培养基GibcoC11995500BT
胎牛血清Gibco10099141
青霉素HyCloneSV30010
胰蛋白酶/EDTAGibco25200056
CCK-8试剂盒MCE--
Annexin V-FITCMilliporeAPOAF-50TST
碘化丙啶MilliporeAPOAF-50TST
抗α1A抗体Proteintech19777-1-AP
抗α1B抗体AffinityDF8798
抗α1D抗体Abcamab166925
抗α2A多克隆抗体Proteintech14266-1-AP
抗α2B抗体ABclonalA8535
抗α2C抗体AffinityDF3108
抗β1抗体Biossbs-0498R
抗β2抗体AffinityDF3512
抗β3抗体Biossbs-1063R
抗GAPDH抗体Proteintech10494-1-AP
二抗CWBIO--
化学发光检测试剂Merck Millipore--
TDT System-IIITucker-Davis Technologies--
TDT WS-8工作站Tucker-Davis Technologies--
Radio Shack Super TweeterRadio Shack--
声级计Bruel and Kjaer--
荧光显微镜Olympus--
酶标仪Bio-Rad--
FC500流式细胞仪Beckman--
eBlot Touch Imagere-Blot--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
SCGx手术
手术侧别(单侧/双侧)和手术成功的确认(Horner's综合征)
阅读提示:材料与方法- SCGx部分
噪声暴露
噪声频率(4 kHz倍频带)、强度(115 dB SPL)、持续时间(每天6小时,连续2天)和暴露时间点
阅读提示:材料与方法- 噪声暴露部分
听觉功能评估
ABR测试频率(4, 8, 16, 24, 32 kHz)和DPOAE测试频率范围(4-40 kHz)以及测试时间点(1小时、3、7、14天)
阅读提示:材料与方法- ABRs和DPOAEs部分
体外细胞实验
H2O2浓度(0.2-0.8 mM)和NE浓度(0.1-50 µM)及处理时间(1, 3, 5小时)
阅读提示:材料与方法- 细胞培养和处理、CCK-8 assay、流式细胞术部分
Western blot
蛋白上样量(25 µg)和一抗稀释比例
阅读提示:材料与方法- Western blot部分