SCGx手术及效果确认
建立去除交感神经支配的大鼠模型,并验证手术成功。
对Sprague-Dawley大鼠进行双侧、单侧SCG切除或假手术,通过观察Horner's综合征确认手术成功。
Norepinephrine protects against cochlear outer hair cell damage and noise-induced hearing loss via α2A-adrenergic receptor.
包含体内SCGx大鼠模型结合ABR、DPOAE和免疫荧光验证,以及体外HEI-OC1细胞氧化应激、CCK-8、流式细胞术和Western blot功能与机制验证。
Sprague-Dawley大鼠(SCGx模型) HEI-OC1细胞系
SCGx手术的有效性(通过Horner's综合征确认) 噪声暴露参数:4 kHz倍频带噪声,115 dB SPL,每天6小时,连续2天 H2O2浓度(0.2-0.8 mM)和NE浓度(0.1-50 µM)及处理时间 α2A-AR在耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元中的表达
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立去除交感神经支配的大鼠模型,并验证手术成功。
对Sprague-Dawley大鼠进行双侧、单侧SCG切除或假手术,通过观察Horner's综合征确认手术成功。
评估SCGx对噪声暴露后听觉功能的影响。
术后恢复两周后,大鼠接受噪声暴露,并在暴露后1小时、3天、7天、14天测量ABR和DPOAE。
检测SCGx和噪声暴露对外毛细胞存活的影响。
噪声暴露后14天,取耳蜗进行免疫荧光染色,计数外毛细胞损失。
建立HEI-OC1细胞氧化应激模型,模拟噪声诱导的ROS损伤。
用不同浓度的H2O2处理HEI-OC1细胞不同时间,评估细胞活力。
验证NE对H2O2诱导的细胞损伤的保护作用。
用NE和H2O2共处理HEI-OC1细胞,通过CCK-8和流式细胞术检测细胞活力和凋亡。
鉴定参与NE保护作用的肾上腺素能受体亚型。
通过Western blot检测噪声暴露和对照组耳蜗中九种AR亚型的表达变化,并通过免疫荧光定位α2A-AR和DBH。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光 | 鬼笔环肽 | Cytoskeleton, Inc. | PHDR1 |
| DAPI | Solarbio Corporation | -- | |
| Hoechst 33342 | Yeasen | -- | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-50G | |
| 抗α2A-AR抗体 | abcam | ab85570 | |
| 抗DBH抗体 | Affinity Biosciences | DF7060 | |
| 抗β3抗体 | Millipore | MAB1637 | |
| Alexa 488标记的驴抗兔二抗 | Thermo Fisher | A-21206 | |
| Alexa 594标记的山羊抗小鼠二抗 | Thermo Fisher | A11005 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 青霉素 | HyClone | SV30010 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | MCE | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC | Millipore | APOAF-50TST |
| 碘化丙啶 | Millipore | APOAF-50TST | |
| 蛋白质印迹 | 抗α1A抗体 | Proteintech | 19777-1-AP |
| 抗α1B抗体 | Affinity | DF8798 | |
| 抗α1D抗体 | Abcam | ab166925 | |
| 抗α2A多克隆抗体 | Proteintech | 14266-1-AP | |
| 抗α2B抗体 | ABclonal | A8535 | |
| 抗α2C抗体 | Affinity | DF3108 | |
| 抗β1抗体 | Bioss | bs-0498R | |
| 抗β2抗体 | Affinity | DF3512 | |
| 抗β3抗体 | Bioss | bs-1063R | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 二抗 | CWBIO | -- | |
| 化学发光检测试剂 | Merck Millipore | -- | |
| ABR检测 | TDT System-III | Tucker-Davis Technologies | -- |
| DPOAE检测 | TDT WS-8工作站 | Tucker-Davis Technologies | -- |
| 噪声暴露 | Radio Shack Super Tweeter | Radio Shack | -- |
| 声级计 | Bruel and Kjaer | -- | |
| 显微镜观察 | 荧光显微镜 | Olympus | -- |
| 细胞活力检测 | 酶标仪 | Bio-Rad | -- |
| 流式细胞术 | FC500流式细胞仪 | Beckman | -- |
| 蛋白质印迹成像 | eBlot Touch Imager | e-Blot | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SCGx手术 | 手术侧别(单侧/双侧)和手术成功的确认(Horner's综合征) 阅读提示:材料与方法- SCGx部分 |
| 噪声暴露 | 噪声频率(4 kHz倍频带)、强度(115 dB SPL)、持续时间(每天6小时,连续2天)和暴露时间点 阅读提示:材料与方法- 噪声暴露部分 |
| 听觉功能评估 | ABR测试频率(4, 8, 16, 24, 32 kHz)和DPOAE测试频率范围(4-40 kHz)以及测试时间点(1小时、3、7、14天) 阅读提示:材料与方法- ABRs和DPOAEs部分 |
| 体外细胞实验 | H2O2浓度(0.2-0.8 mM)和NE浓度(0.1-50 µM)及处理时间(1, 3, 5小时) 阅读提示:材料与方法- 细胞培养和处理、CCK-8 assay、流式细胞术部分 |
| Western blot | 蛋白上样量(25 µg)和一抗稀释比例 阅读提示:材料与方法- Western blot部分 |