黄连素通过减少炎症和增加自噬治疗荨麻疹

Palmatine treats urticaria by reducing inflammation and increasing autophagy.

作者信息Tian Xiao, Xingzhi Yu, Liping Yang, Xiaohua Duan
PMID38035098
发布时间2023-11-14
DOI10.3389/fimmu.2023.1268467

实验完整度

研究包含OVA诱导的CSU大鼠模型,观察行为学、组织病理、炎症因子、肥大细胞及自噬蛋白等多个指标,但缺少体外及患者样本验证,未明确功能验证。

主要模型

OVA诱导的CSU大鼠模型

重点核对

CSU大鼠模型:通过腹腔注射卵清蛋白(OVA)诱导,在第0、2、4天给予1 mg OVA铝佐剂悬液,第14天给予2 mg OVA。 分组:大鼠随机分为Control、OVA、OVA+LOR(氯雷他定0.9 mg/kg)和OVA+PAL(40 mg/kg)组,每组6只。 给药方式:PAL、LOR和生理盐水在第5-14天每天一次灌胃。 检测指标:皮肤瘙痒行为、皮肤组织病理(HE染色)、肥大细胞计数(甲苯胺蓝染色)、炎症因子(IL-4、IL-6、IL-12、IFN-γ、IL-17A、IL-23)水平、血清IgE、LTB4、组胺水平、自噬相关蛋白表达(Western blot和免疫荧光)。 统计分析:数据以平均值±标准差表示,多组比较采用ANOVA(方差不齐时用Welch's ANOVA)或Kruskal-Wallis检验,P<0.05为差异有统计学意义。

摘要

慢性自发性荨麻疹(CSU)主要表现为皮肤上的风团和红斑,伴有瘙痒,这会导致情绪焦虑并严重影响患者的生活质量。黄连素(PAL)是雅解沙把的主要化学成分之一,已被发现能有效缓解食物过敏的症状。然而,其在CSU中的作用和机制仍不清楚。本研究旨在探讨PAL对CSU大鼠的保护作用。 方法 我们通过在0、2、4和14天对大鼠腹腔注射卵清蛋白(OVA)来复制CSU大鼠模型,并在最后一次激发时给予双倍剂量。从第5天到第14天,通过灌胃给予PAL、氯雷他定和生理盐水。我们观察了CSU大鼠的皮肤病理变化、肥大细胞脱颗粒、免疫因子水平、炎症反应和自噬相关蛋白的表达。 结果 我们发现PAL治疗能有效减轻CSU样皮肤病变,并减少大鼠的瘙痒和肥大细胞脱颗粒。与OVA组相比,免疫和炎症因子水平显著降低,中性粒细胞募集得到缓解,表明炎症反应减轻。自噬结果显示,PAL进一步增加了LC3、Beclin-1和p-LKB1、p-AMPK、Atg5、Atg12和Atg5-Atg12的表达,而P62和p-p70S6K1的表达降低。它们共同表明PAL治疗后自噬流被激活。然而,LC3I表达增加,可能是因为PAL诱导其积累以提供更多LC3II生成的底物。 讨论 总体而言,PAL对正常大鼠的CSU具有保护作用,激活了自噬的表达并改善了炎症反应。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
PAL对慢性自发性荨麻疹(CSU)大鼠模型是否具有保护作用,其机制是否涉及减轻炎症和激活自噬。
核心机制
PAL通过激活LKB1/AMPK信号通路,增强自噬流(增加Beclin-1、LC3II、Atg5-Atg12表达,降低P62和p-p70S6K1水平),从而减少炎症因子释放和肥大细胞脱颗粒,改善CSU症状。
主要证据
在OVA诱导的CSU大鼠模型中,PAL治疗显著减轻瘙痒和皮肤病理损伤,降低炎症因子(IL-4、IL-6、IL-12、IFN-γ、IL-17A、IL-23)水平,减少中性粒细胞浸润,同时增加自噬相关蛋白表达。
研究意义
研究为PAL作为治疗CSU的潜在药物提供了药效学依据,并提示其可能通过调节自噬和炎症反应发挥作用。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立CSU大鼠模型

通过OVA致敏建立慢性自发性荨麻疹大鼠模型,模拟人类CSU的病理特征。

在实验第0、2、4天腹腔注射含1 mg OVA的铝佐剂悬液,第14天注射含2 mg OVA的铝佐剂悬液,对照组注射生理盐水。

2

药物治疗

评估PAL对CSU大鼠模型的干预效果,并与阳性对照氯雷他定比较。

从第5天到第14天,每天一次通过灌胃给予大鼠生理盐水(OVA组和Control组)、0.9 mg/kg氯雷他定(LOR组)或40 mg/kg PAL(PAL组)。

3

行为学评估

评估PAL对CSU大鼠瘙痒行为的影响。

在最后一次OVA注射后10分钟,观察大鼠20分钟的抓挠行为,记录抓挠次数。

4

组织病理学检查

评估PAL对CSU大鼠皮肤组织病理学改变的影响。

通过HE染色观察皮肤组织形态,甲苯胺蓝染色计数肥大细胞,免疫组织化学检测MCT和EPX表达。

5

炎症因子和免疫指标检测

评估PAL对CSU大鼠炎症反应和过敏反应的影响。

采用ELISA检测皮肤组织中IL-4、IL-6、IL-12、IL-17A、IL-23和IFN-γ的浓度,以及血清中IgE、LTB4和组胺的浓度;通过免疫荧光染色检测Ly6G阳性细胞评估中性粒细胞浸润。

6

自噬活性检测

评估PAL对CSU大鼠皮肤自噬活性的影响。

使用透射电镜观察自噬囊泡数量,通过免疫荧光和Western blot检测自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3、P62、LKB1、p-AMPK、AMPK、p70S6K1、p-p70S6K1、Atg5、Atg12、Atg5-Atg12复合物)的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
卵清蛋白Sigma AldrichS7951
氯雷他定MCEHY-17043
黄连素ABPHYTOAFBF2751
HE染色试剂盒KeyGEN BiotechKGA224
甲苯胺蓝溶液ServicebioG1032
免疫组化试剂盒MaximKIT-5001
抗TPSAB1抗体Proteintech13343-1-AP
抗EPX抗体Biossbs-3881R
IL-4 ELISA试剂盒SolarbioSEKR-0004
IL-6 ELISA试剂盒SolarbioSEKR-0005
IL-12 ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-R0064c
IL-17A ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-R0566c
IL-23 ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-R0569c
IFN-γ ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-R0009
IgE ELISA试剂盒SolarbioSEKR-0019
LTB4 ELISA试剂盒CusabioCSB-E08035r
组胺ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-0032c
RIPA裂解液BeyotimeP0013B
PVDF膜Millipore--
DAPISanta Cruzsc-24941
抗Beclin-1抗体Prointech66665-1-Ig
抗LC3A/B抗体Prointech4108
抗P62抗体Prointech18420-1-AP
抗LKB1抗体Prointech3047
抗AMPK抗体Proteintech5831
抗磷酸化p70S6K1抗体Abcamab32529
Atg5-Atg12复合物抗体Bio-RadAAM79
山羊抗大鼠IgG H&L(HRP)Abcamab150157
山羊抗兔IgG H&L(HRP)Abcamab6721
增强化学发光试剂盒Thermo Fisher Scientific--
天能6600发光成像工作站Tanon--
相差显微镜Olympus Corporation--
光学显微镜Olympus Corporation--
激光共聚焦显微镜----
荧光显微镜----
透射电子显微镜Thermo Fisher Scientific--
酶标仪Berthold Technologies GmbH--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
SD大鼠的性别、年龄、体重、来源;OVA剂量和注射时间;麻醉方法未明确说明。
阅读提示:Material and methods, 2.2 Experimental schedule and model replication
药物治疗
PAL剂量、LOR剂量、给药途径、给药时间;溶解于何种溶媒未明确说明。
阅读提示:Material and methods, 2.2 Experimental schedule and model replication
组织病理学检查
组织固定、脱水、包埋方法;HE染色试剂盒;甲苯胺蓝染色浓度和时间;免疫组化抗体稀释度。
阅读提示:Material and methods, 2.4.2, 2.4.4, 2.4.5
炎症因子检测
皮肤组织匀浆制备方法;ELISA试剂盒种类;血清分离方法。
阅读提示:Material and methods, 2.4.3, 2.4.6
自噬检测
电镜制样步骤;Western blot抗体稀释度;免疫荧光抗体浓度。
阅读提示:Material and methods, 2.4.7, 2.4.8, 2.4.9