小鼠肝脏再生模型建立与表型观察
观察Shp2缺失后肝细胞增殖模式的变化，寻找补偿性增殖的细胞群体。
对WT和SKO小鼠进行2/3部分肝切除，在不同时间点收集肝脏，进行免疫荧光染色和H&E染色，检测Ki67、CD133等标志物。
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识别细胞间通讯中的CD133+ intercellsome以补偿细胞内信号缺陷
Identification of CD133+ intercellsomes in intercellular communication to offset intracellular signal deficit.
实验完整度
高包含多个证据层级：小鼠肝脏再生模型、细胞系实验、类器官培养、单细胞RNA测序和超微结构分析，并进行了CD133功能缺失验证。
主要模型
小鼠部分肝切除模型 Shp2缺陷原代肝细胞 PLC/PRF/5肝癌细胞系 小鼠肠道类器官
重点核对
Shp2缺失（Alb-Cre;Shp2flox/flox）或MET缺失小鼠模型 Shp2抑制剂SHP099（10 μM）或MEK抑制剂Trametinib（10 nM）处理 CD133+ intercellsome的分离与RNA含量分析 单细胞RNA测序分析肝细胞IEG表达 Prom1敲除（DKO）小鼠及类器官实验
摘要
CD133（prominin 1）被广泛认为是癌症干细胞标志物，与耐药性和癌症复发相关。在此，我们报道，在RTK-Shp2-Ras-Erk信号受损的情况下，异质性肝细胞形成能够在小鼠肝脏再生过程中分裂的细胞团。这些肝细胞的特征是CD133上调，而其他祖细胞标志物阴性。药物抑制增殖信号也在来自多种动物物种的各种癌细胞类型中诱导CD133表达，表明这是一种固有的、常见的应激反应机制。超分辨率和电子显微镜将CD133定位于细胞内囊泡上，这些囊泡似乎在细胞间迁移，我们将其命名为“intercellsome”。分离的CD133+ intercellsome富含mRNA而非miRNA。单细胞RNA测序显示，Shp2缺陷细胞中有丝分裂原mRNA的细胞内多样性（熵）较低，这可以通过CD133+细胞间的mRNA交换来补救。CD133缺陷细胞在肝脏和肠道类器官中对增殖信号抑制更敏感。这些数据表明了一种细胞间通讯机制，以补偿各种细胞类型中的细胞内信号缺陷。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在增殖信号受损时，少数肝细胞如何克服信号缺陷而重新获得增殖能力？
- 核心机制
- CD133+ intercellsome介导邻近细胞间有丝分裂原mRNA的交换，将细胞间的随机异质性转化为细胞内的转录多样性（熵），从而在整体信号缺陷下维持增殖。
- 主要证据
- 在Shp2缺陷肝脏中，CD133+细胞团中Ki67+肝细胞比例显著升高；分离的CD133+囊泡富含IEG mRNA；scRNA-seq显示CD133+细胞IEG多样性增高；CD133缺失（Prom1 KO）在信号抑制下降低细胞增殖。
- 研究意义
- 揭示了CD133在细胞间通讯中的新功能，为理解耐药性和肿瘤复发提供了潜在机制，并提示抑制intercellsome功能可能成为克服耐药的新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CD133+细胞克隆起源分析
确定CD133+细胞簇的来源是单一祖细胞克隆还是多个成熟肝细胞的聚集。
通过尾静脉水动力注射转座子系统标记肝细胞，结合部分肝切除，分析GFP标记的克隆大小和组成。
CD133诱导的保守性验证
验证CD133上调是否是对增殖信号缺陷的普遍应激反应。
在MET缺陷小鼠中诱导损伤，并用Shp2或MEK抑制剂处理多种细胞系，检测CD133表达。
CD133+ vesicles的鉴定与分离
明确CD133在细胞内的定位，并分离CD133+囊泡以分析其特征。
用STORM超分辨率显微镜和免疫金电子显微镜观察CD133定位；用抗CD133抗体磁珠从SKO肝组织和PLC细胞中分离CD133+囊泡。
CD133+ vesicle的货物分析
确定CD133+囊泡中携带的RNA种类，以推测其功能。
对分离的CD133+囊泡进行RNA电泳、RT-qPCR和RNA-seq，分析mRNA和miRNA含量，并与外泌体比较。
细胞间转运验证
证明CD133+囊泡能够在细胞间转移。
将稳定表达CD133-Myc或CD133-GFP的细胞与mCherry标记细胞混合培养，通过免疫荧光和CLEM检测CD133融合蛋白的转移。
单细胞RNA测序分析
分析CD133+和CD133-肝细胞中IEG表达多样性，验证mRNA交换假说。
对PHx后4小时和2天的WT和SKO肝细胞进行scRNA-seq，分析IEG表达，计算熵和变异，并进行数学模拟。
CD133功能缺失实验
验证CD133在信号缺陷下维持细胞增殖的功能。
用Prom1 KO小鼠与Shp2 KO杂交，或用AAV-Cre在肝脏敲除Shp2，分析肝细胞增殖；分离原代肝细胞和肠道隐窝细胞培养，观察类器官增殖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | SHP099 | -- | CT-SHP099 |
| 曲美替尼 | APExBIO | A3018 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| DMEM-F12培养基 | Gibco | -- | |
| Williams' E培养基 | Gibco | -- | |
| 原代肝细胞维持添加物 | Gibco | CM4000 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 马血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 人EGF | Gemini | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 霍乱毒素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 人胰岛素 | Gemini | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| CD133-Myc-Tag表达载体 | SinoBiological | HG15024-CM | |
| 免疫染色 | Ki67抗体 | eBioscience | 14-5698-80 |
| HNF4α抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | |
| 小鼠CD133抗体 | eBioscience | 14-1331-82 | |
| 人CD133抗体 | CST | 86781 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7870 | |
| GFP抗体 | Nacalai Tesque | 04404-84 | |
| Shp2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-280 | |
| Porcupine抗体 | abcam | ab105543 | |
| β-连环蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7199 | |
| CHMP2B抗体 | abcam | ab157208 | |
| HuR抗体 | abcam | ab200342 | |
| HuR抗体 | proteintech | 66549-1-Ig | |
| VE-钙黏蛋白抗体 | R&D SYSTEMS | AF1002 | |
| BrdU抗体 | BD Biosciences | 555627 | |
| PECAM抗体 | eBioscience | 13-0311-81 | |
| HGF抗体 | abcam | ab83760 | |
| GFAP抗体 | Dako | Z0334 | |
| EpCAM抗体 | BD Biosciences | 552370 | |
| Sox9抗体 | Millipore | AB5535 | |
| CD44v6抗体 | GeneTex | GTX75661 | |
| AFP抗体 | R&D SYSTEMS | AF5369 | |
| 免疫印迹 | EpCAM抗体 | Bioss | bs-1513R |
| HNF4α抗体 | GeneTex | GTX89532 | |
| GAPDH抗体 | CST | 5174 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A5316 | |
| Stat3抗体 | CST | 9132 | |
| Erk1/2抗体 | CST | 4695 | |
| 细胞周期蛋白D1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| RNA原位杂交 | HCR RNA-FISH探针 | Molecular Instruments | -- |
| ProtectRNA RNase抑制剂 | SIGMA | R7397 | |
| 肝细胞分离 | 胶原酶H | Roche | 11074059001 |
| DNaseI | Roche | 10104159001 | |
| IV型胶原酶 | Gibco | 17104019 | |
| 类器官培养 | 基质胶 | -- | -- |
| B27添加物 | Gibco | 17504044 | |
| N2添加物 | Gibco | 17502048 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | -- | -- | |
| EGF | -- | -- | |
| Noggin | -- | -- | |
| R-spondin 1 | -- | -- | |
| 质粒制备 | GenElute HP无内毒素质粒大提试剂盒 | Sigma | NA0410 |
| 囊泡分离 | FITC偶联抗CD133抗体 | Invitrogen | 11-1331-82 |
| FITC选择混合液 | STEMCELL TECHNOLOGY | 18558 | |
| MACS MS柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| RNeasy Plus Micro试剂盒 | QIAGEN | 74034 | |
| Anti-PE MultiSort试剂盒 | Miltenyi | 130-090-757 | |
| 外泌体分离 | 总外泌体分离试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | High-Capacity cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 |
| DyNAmo Flash SYBR Green qPCR试剂盒 | Thermo Scientific | F415S | |
| 动物实验 | AAV-Cre | Penn Vector Core | -- |
| DEN | Sigma | N0258-1G | |
| BrdU | Sigma | -- | |
| 单细胞RNA-seq | Chromium单细胞3'试剂盒（v3） | 10x Genomics | -- |
| HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- | |
| RNA-seq | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 显微镜 | Nikon A1R TIRF STORM显微镜 | Nikon | -- |
| Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | SKO小鼠基因型（Alb-Cre;Shp2flox/flox），PHx手术年龄（8-10周），CCl4剂量（20% in 100 μl corn oil/20g体重），AAV-Cre注射剂量（2x10^11/28g体重） 阅读提示：Materials and methods - Animals |
| 药物处理条件 | SHP099浓度（10 μM for PLC, 20 μM for MCF10A），Trametinib浓度（10 nM），处理时间（2-6天） 阅读提示：Materials and methods - Cell culture and experiments |
| 原代肝细胞培养 | 胶原酶灌注方案（Collagenase H或IV），分离步骤（离心速度和时间），培养条件（Williams' Media E + supplements，胶原包被板） 阅读提示：Materials and methods - Primary hepatocyte isolation and culture |
| 肠道类器官培养 | 隐窝分离方法（EDTA处理步骤），培养条件（Matrigel，培养基添加物），Trametinib浓度（50 nM） 阅读提示：Materials and methods - Intestinal organoid culture |
| CD133+囊泡分离 | 裂解方法（肝灌注+Dounce匀浆），抗体用量，MACS分离流程，RNA提取方法（RNeasy Plus Micro Kit） 阅读提示：Materials and methods - Isolation of CD133+ vesicles |
| 单细胞RNA-seq分析 | 细胞分离（两步灌流、Percoll纯化），10x Genomics上样（5000 GEMs），测序参数，数据过滤标准（基因数200-5000，线粒体UMI<20%），分析时限定门静脉周围亚群 阅读提示：Materials and methods - Single-cell RNA library construction and sequencing, Single-cell RNA-seq data preprocessing, Detection of cell subpopulations |