体外细胞模型建立与药物浓度筛选
确定Lok对BEAS-2B细胞的适宜作用浓度，并建立TGF-β1诱导的EMT细胞模型。
使用CCK-8法检测不同浓度Lok处理BEAS-2B细胞48小时的活力，确定IC50和实验浓度；用不同浓度TGF-β1处理不同时间，通过形态观察和Western blot检测EMT标志物确定最佳诱导条件。
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罗欧克祖帕煎剂通过PI3K-Akt/HIF-1α信号通路减轻慢性哮喘中支气管EMT介导的气道重塑
Loke zupa decoction attenuates bronchial EMT-mediated airway remodelling in chronic asthma through the PI3K-Akt/HIF-1α signaling pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK-8、划痕、Western blot）和体内动物模型（OVA诱导哮喘小鼠，组织学、ELISA、Western blot、RT-qPCR），并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
BEAS-2B人支气管上皮细胞 OVA诱导的BALB/c小鼠哮喘模型
重点核对
体外实验TGF-β1诱导浓度10 ng/mL，处理48小时 Lok给药浓度20、40、80 μg/mL 体内OVA致敏和激发方案（100 μg OVA和1 mg氢氧化铝致敏，5% OVA雾化激发8周） Lok灌胃剂量4.55和9.1 g/kg/天，地塞米松0.5 mg/kg
摘要
背景：罗欧克祖帕煎剂（Lok）是一种经典的新疆民间治疗哮喘的药物。目的：我们试图研究Lok对哮喘气道重塑的作用和机制，并为哮喘的预防和治疗提供新的见解。材料与方法：体外实验中，BEAS-2B细胞分为六组：对照组、TGF-β1（10 μM）、TGF-β1+Lok-20、TGF-β1+Lok-40、TGF-β1+Lok-80 μg/mL和TGF-β1+SB431542（5 μM）。进行CCK8和划痕实验。体内实验中，60只雌性BALB/c小鼠随机分为5组：对照组、模型组、Lok-4.55、Lok-9.1和DEX组。在激发阶段，Lok通过灌胃给药连续8周（4.55和9.1 g/kg/天）。我们研究了肺部的气道炎症和气道重塑，并验证了EMT相关标志物和PI3K-Akt/HIF-1α信号通路的激活状态。结果：体外，Lok有效抑制TGF-β1诱导的BEAS-2B细胞增殖能力（细胞活力165% vs. 105%）和迁移（迁移面积85% vs. 35%），且不影响其正常生长（48小时IC50为274.2 µg/mL）。体内，Lok有效保护小鼠免受哮喘，表现为组织学损伤和BALF中细胞因子（IL-4、IL-13和TGF-β1）水平降低17%–77%。机制研究发现，Lok降低了EMT相关分子的水平，并显著下调了PI3K-Akt/HIF-1α信号通路。讨论与结论：我们的研究结果为Lok对哮喘的保护作用及其潜在机制提供了新的见解，为这一患者群体提供了理论基础和潜在的治疗可能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 罗欧克祖帕煎剂（Lok）是否通过抑制上皮间质转化（EMT）和PI3K-Akt/HIF-1α信号通路来减轻哮喘气道重塑。
- 核心机制
- Lok通过下调PI3K-Akt/HIF-1α信号通路，抑制TGF-β1诱导的EMT，从而减轻气道重塑。
- 主要证据
- 体外实验中Lok抑制TGF-β1诱导的BEAS-2B细胞增殖和迁移，并逆转EMT标志物表达；体内实验中Lok减轻OVA诱导的哮喘小鼠气道炎症和重塑，降低EMT标志物及p-PI3K、p-Akt、HIF-1α水平。
- 研究意义
- 为Lok治疗哮喘提供理论依据和潜在治疗可能性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能验证：Lok对TGF-β1诱导的BEAS-2B细胞增殖和迁移的影响
验证Lok是否抑制TGF-β1诱导的细胞增殖和迁移。
使用CCK-8法检测细胞增殖，划痕实验检测细胞迁移，并观察细胞形态变化。
体外机制验证：Lok对EMT标志物和PI3K-Akt/HIF-1α通路的影响
验证Lok是否通过抑制EMT和PI3K-Akt/HIF-1α通路发挥作用。
Western blot检测EMT标志物（E-cadherin、N-cadherin、α-SMA）及通路蛋白（p-PI3K、p-Akt、HIF-1α）的表达。
体内动物模型建立与药物干预
在OVA诱导的慢性哮喘小鼠模型中评估Lok对气道炎症和重塑的作用。
60只雌性BALB/c小鼠随机分为5组，OVA致敏和激发建立哮喘模型，Lok或地塞米松灌胃给药8周，收集BALF和肺组织进行后续检测。
体内炎症和重塑评估
评估Lok对气道炎症和重塑的改善作用。
BALF中炎症细胞计数、ELISA检测细胞因子（IL-4、IL-13、TGF-β1）、H&E染色、Masson染色、PAS染色、羟脯氨酸含量测定。
体内机制验证
验证Lok对EMT和PI3K-Akt/HIF-1α通路的影响。
Western blot和RT-qPCR检测肺组织中EMT标志物（E-cadherin、N-cadherin、α-SMA）及通路蛋白（p-PI3K、p-Akt、HIF-1α）的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞处理 | 转化生长因子-β1 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Bioss | -- |
| 细胞处理 | SB431542 | MCE | HY-10431 |
| 动物模型 | 卵清蛋白 | Sigma Aldrich | -- |
| 氢氧化铝 | Sigma Aldrich | -- | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| BALF细胞计数 | BC-5000Vet | Mindray | -- |
| ELISA | IL-4 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0043c |
| IL-13 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0727c | |
| TGF-β1 ELISA试剂盒 | Jianglabic | JL12223-96T | |
| 羟脯氨酸测定 | 羟脯氨酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| E-钙黏蛋白抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| N-钙黏蛋白抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Proteintech | 14395-1-AP | |
| AKT抗体 | Proteintech | 60203-2-lg | |
| 磷酸化AKT抗体 | Proteintech | 66444-1-lg | |
| HIF-1α抗体 | Proteintech | 20960-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗PI3K抗体 | Bioss | bs-10657R | |
| 抗磷酸化PI3K抗体 | ABclonal | AP0854 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| 引物 | Sangon Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞实验 | TGF-β1诱导浓度10 ng/mL，处理48小时；Lok浓度20、40、80 μg/mL；SB431542浓度5 μM 阅读提示：Methods中的Cell culture, treatment；Figure legends图2、3、4、5 |
| 动物模型建立 | BALB/c小鼠，雌性，18-20 g，5-6周龄；OVA致敏（100 μg OVA+1 mg氢氧化铝，第0、7、14天）；5% OVA雾化激发，30分钟/次，隔天一次，连续8周 阅读提示：Methods中的Ovalbumin (OVA)-induced asthma model；Figure 6(a) |
| 药物干预 | Lok剂量4.55和9.1 g/kg/天，地塞米松0.5 mg/kg，灌胃给药，激发前1小时 阅读提示：Methods中的Ovalbumin (OVA)-induced asthma model |
| 炎症和重塑评估 | BALF细胞计数、ELISA检测IL-4、IL-13、TGF-β1；H&E、Masson、PAS染色；羟脯氨酸含量 阅读提示：Methods中的Collection of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and cell counts, Quantification of cytokines and growth factors, Determination of HPY, Morphological changes in the airways；Figure 6、7 |
| 机制验证 | Western blot检测EMT标志物和通路蛋白；RT-qPCR检测EMT标志物mRNA；GAPDH作为内参 阅读提示：Methods中的Western blot analysis, Quantitative real-time PCR analysis；Figure 8、9 |