建立体内和体外损伤模型
模拟肝脏缺血再灌注损伤和氧化应激损伤，以研究Ac2-26的保护作用。
建立小鼠HIRI模型（夹闭肝蒂45 min再灌注24 h）和H2O2诱导的AML12细胞氧化损伤模型（200 µM H2O2处理6 h）。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Ac2-26通过调节IL-22/IL-22R1/STAT3信号通路减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤
Ac2-26 attenuates hepatic ischemia-reperfusion injury in mice via regulating IL-22/IL-22R1/STAT3 signaling.
实验完整度
高包含体内小鼠HIRI模型和体外AML12细胞氧化损伤模型，并进行了功能验证（凋亡、氧化应激、线粒体功能）和机制验证（STAT3通路及CLN干预）
主要模型
C57BL/6小鼠肝脏缺血再灌注模型 AML12小鼠肝细胞系
重点核对
Ac2-26给药剂量：250 µg/kg（小鼠）和0.8 µM（细胞）；给药方式：腹腔注射；给药时间：缺血前30 min 细胞处理：200 µM H2O2诱导损伤，Ac2-26处理6 h；CLN（1 µM）预处理1 h 小鼠模型：C57BL/6小鼠，雄性，6-8周龄，22-25 g，随机分为4组（每组n=8） 缺血再灌注条件：夹闭肝蒂左、中叶分支45 min，再灌注24 h 统计设计：至少三次重复，数据以均值±SEM表示，使用单因素方差分析和LSD检验
摘要
肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）是与肝脏手术相关的发病率和死亡率的主要原因之一。Ac2-26是膜联蛋白A1蛋白的短肽，已被证明对缺血再灌注损伤具有保护作用。然而，它是否对HIRI发挥保护作用尚未见报道。建立HIRI小鼠模型和H2O2诱导的AML12细胞氧化损伤模型，以研究Ac2-26是否通过调节IL-22/IL-22R1/STAT3信号通路的激活来减轻HIRI。通过多种与肝功能、凋亡、炎症反应、线粒体功能以及IL-22、IL-22R1、p-STAT3Tyr705表达相关的生化参数来测量Ac2-26的保护作用。我们发现Ac2-26降低了Suzuki评分和细胞死亡率，并提高了HIRI后的细胞活力。此外，我们揭示Ac2-26显著减少了凋亡肝细胞的数量，以及cleaved-caspase-3的表达和Bax/Bcl-2比值。此外，HIRI增加了丙二醛（MDA）、NADP+/NADPH比值和活性氧（ROS）的含量，而Ac2-26显著降低了它们。另外，Ac2-26显著减轻了线粒体功能障碍，表现为三磷酸腺苷（ATP）含量和线粒体膜电位增加，线粒体DNA（mtDNA）损伤减少。最后，我们揭示Ac2-26预处理能显著抑制IL-22/IL-22R1/STAT3信号的激活。总之，这项工作表明Ac2-26通过减少氧化应激和抑制线粒体凋亡途径改善HIRI，这可能与抑制IL-22/IL-22R1/STAT3信号通路密切相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Ac2-26是否能够减轻肝脏缺血再灌注损伤，其机制是否与调节IL-22/IL-22R1/STAT3信号通路有关？
- 核心机制
- Ac2-26通过抑制IL-22/IL-22R1/STAT3信号通路的激活，减少氧化应激和线粒体凋亡途径，从而减轻HIRI。
- 主要证据
- 在小鼠HIRI模型和H2O2诱导的AML12细胞模型中，Ac2-26降低了Suzuki评分、细胞死亡率、凋亡细胞数、cleaved-caspase-3表达和Bax/Bcl-2比值，减少了MDA、ROS和NADP+/NADPH比值，改善了线粒体功能，并抑制了IL-22、IL-22R1和p-STAT3Tyr705的表达；STAT3激活剂CLN逆转了Ac2-26的保护作用。
- 研究意义
- 本研究为Ac2-26在HIRI治疗中的临床应用提供了初步证据，并可能有助于开发更有效的HIRI疗法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估肝损伤和组织形态学
评估Ac2-26对HIRI小鼠肝组织病理损伤的影响。
通过HE染色观察肝组织病理变化，并使用Suzuki评分评估损伤程度。
检测炎症反应
评估Ac2-26对HIRI诱导的炎症因子表达的影响。
通过Western blot检测肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达，ELISA检测血清TNF-α水平。
检测细胞凋亡
评估Ac2-26对体内和体外凋亡的影响。
TUNEL染色检测体内凋亡，Hoechst 33342染色和Annexin V-APC/7-AAD流式检测体外凋亡，Western blot检测凋亡相关蛋白。
评估氧化应激水平
评估Ac2-26对HIRI诱导的氧化应激的影响。
检测肝脏MDA含量、NADP+/NADPH比值，以及AML12细胞内ROS水平。
评估线粒体功能
评估Ac2-26对H2O2诱导的线粒体损伤的影响。
检测mtDNA损伤（qRT-PCR检测mtAtp6/Rp113、COX-1、ND1），线粒体膜电位（Rh123染色），ATP含量。
检测IL-22/IL-22R1表达
评估Ac2-26对HIRI诱导的IL-22及其受体表达的影响。
qRT-PCR和Western blot检测IL-22和IL-22R1的mRNA和蛋白表达。
检测STAT3信号通路激活
评估Ac2-26对HIRI诱导的STAT3激活的影响，并验证其机制。
Western blot检测p-STAT3Tyr705表达，并使用STAT3激活剂CLN干预以验证Ac2-26的保护作用依赖于抑制STAT3。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | Ac2-26 | Qiang Yao Biotechnology Company | -- |
| Colivelin TFA | MedChemExpress | HY-P1061A | |
| 细胞处理 | 过氧化氢 | Sigma | 18304 |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | 7sea-biotech | C008 |
| Western blot | 抗cleaved-caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9665 |
| 抗磷酸化STAT3 (Tyr705)抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| 抗IL-22抗体 | Bioss | bs-2623R | |
| 抗IL-22R1抗体 | Bioss | bs-2624R | |
| 抗IL-6抗体 | Bioss | bs-0782R | |
| 抗IL-1β抗体 | Bioss | bs-0812R | |
| 抗Bax抗体 | Santa Cruz | sc-526 | |
| 抗Bcl-2抗体 | Boster | BA0412 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech Group | 60004-1-Ig | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗 | ZSGB-BIO | ZB-2301 | |
| 染色封片 | VECTASHIELD封片剂（含DAPI） | Vector Lab | H-1200-10 |
| Western blot | FITC标记的二抗 | Jackson Immunoresearch | 805-095-180 |
| 氧化应激检测 | 丙二醛检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A003-1-1 |
| ELISA | 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Multi Science | EK282/3 |
| 凋亡检测 | TUNEL检测试剂盒 | Beyotime | C1089 |
| 氧化应激检测 | NADP+/NADPH检测试剂盒 | Beyotime | S0179 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| 线粒体功能检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 |
| 流式凋亡检测 | Annexin V-APC/7-AAD检测试剂盒 | Biolegend | 640930 |
| Western blot | 抗TNF-α抗体 | Solarbio | K009343M |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Solarbio | R0020 |
| 氧化应激检测 | 活性氧检测试剂盒 | Solarbio | CA1410 |
| 逆转录 | ReverTra Ace qPCR RT试剂盒 | TOYOBO | FSQ-101 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| 细胞培养 | DME/F-12培养基 | Hyclone | SH30023.01 |
| 免疫印迹封闭 | 脱脂奶粉 | Yili | Q/NYLB00395 |
| Western blot | 超敏增强化学发光底物试剂盒 | Yanxi Biotechnology | ECL-P-100 |
| 细胞培养 | AML12细胞系 | Chinese Academy of Sciences Cell Bank | RRID: CVCL_0140 |
| 流式检测 | FACS Aria3流式细胞仪 | Becton-Dickinson | -- |
| 酶标检测 | 酶标仪（Multiskan FC） | Thermo Fisher | -- |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜（Olympus FV500） | Olympus | -- |
| Western blot | ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、体重、分组、样本量、Ac2-26剂量、给药途径和时间 阅读提示：Materials and Methods: Animals and treatments |
| 细胞模型 | 细胞系、培养条件、H2O2浓度、Ac2-26浓度、CLN浓度及处理时间 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture and treatment |
| 组织学评估 | HE染色步骤、Suzuki评分标准 阅读提示：Materials and Methods: Histopathological examination |
| 凋亡检测 | TUNEL染色、Hoechst染色、Annexin V-APC/7-AAD流式凋亡检测的样本处理 阅读提示：Materials and Methods: TUNEL staining, Hoechst 33342 staining, Annexin V-APC/7-AAD assay |
| 氧化应激检测 | MDA检测的组织量、NADP+/NADPH检测的组织量、ROS检测的细胞处理 阅读提示：Materials and Methods: MDA assays, NADP+/NADPH ratio determined, Detection of ROS level |
| 线粒体功能检测 | qRT-PCR引物序列、Rh123染色浓度和时间、ATP检测方法 阅读提示：Materials and Methods: Quantitative real-time PCR (qRT–PCR), Rhodamine 123 staining, Enhanced ATP assay |
| 机制验证 | STAT3激活剂CLN的预处理条件，Western blot检测的抗体及浓度 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture and treatment, Western blotting; Results: Ac2-26 prevented the activation of STAT3 induced by HIRI |