长链非编码RNA SPRY4-IT1促进鼻咽癌细胞的增殖和转移

Long non-coding RNA SPRY4-IT1 promotes proliferation and metastasis in nasopharyngeal carcinoma cell.

作者信息Yanfei Li, Zhenpeng Liao, Rong Wang, Zibin Liang, Zhihe Lin, Shiqi Deng, Lei Chen, Zhigang Liu, Shaoyan Feng
PMID35378932
期刊PeerJ
发布时间2022-03-30
DOI10.7717/peerj.13221

实验完整度

包含体外细胞功能实验(增殖、迁移、凋亡)、分子机制验证(Western blot、免疫荧光)和体内动物转移模型,且具有明确的机制验证。

主要模型

鼻咽癌细胞系6-10B 鼻咽癌细胞系HONE-1 BALB/c裸鼠肺转移模型

重点核对

SPRY4-IT1在NPC细胞系中的表达水平(qRT-PCR) siRNA敲低效率及靶序列 CCK-8和集落形成实验中的细胞数量和时间点 Transwell迁移实验的细胞数和时间 流式细胞术检测细胞周期和凋亡的具体方法

摘要

背景:长链非编码RNA SPRY4内含子转录本1(LncRNA SPRY4-IT1)在多种癌症中异常表达。越来越多的证据表明lncRNA参与肿瘤发生和转移。本研究旨在探讨SPRY4-IT1在体外和体内对鼻咽癌(NPC)表型的生物学作用。方法:通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测NPC细胞系中SPRY4-IT1的表达水平。使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和集落形成实验检测细胞增殖。采用划痕愈合实验、Transwell实验和动物实验评估细胞迁移和转移能力。通过流式细胞术测定细胞周期分布和凋亡。采用Western blotting和免疫荧光鉴定蛋白表达。结果:与人永生化鼻咽上皮细胞(NP69)相比,SPRY4-IT1在多个NPC细胞系(6-10B、CNE-2和HONE-1)中显著上调。沉默SPRY4-IT1抑制增殖、迁移和转移,并诱导显著的G2/M期阻滞和凋亡。Western blotting显示,敲低SPRY4-IT1后,细胞周期相关蛋白(cyclin B1、cdc2和p-cdc2)的表达水平下调,凋亡相关蛋白(PARP、cleaved PARP和cleaved caspase-3)的表达水平上调。SPRY4-IT1敲低后,E-cadherin表达升高,Vimentin、Snail和Twist1表达降低。结论:lncRNA SPRY4-IT1在NPC增殖、迁移和转移中发挥重要作用,提示SPRY4-IT1可能成为治疗NPC的潜在靶点。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
SPRY4-IT1在鼻咽癌中的生物学作用及其潜在机制是什么?
核心机制
敲低SPRY4-IT1导致细胞周期相关蛋白(cyclin B1、cdc2、p-cdc2)下调,诱导G2/M期阻滞;并通过调节凋亡相关蛋白(PARP、cleaved-PARP、cleaved-caspase-3)促进凋亡,同时通过调控EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist1)抑制迁移和转移。
主要证据
体外实验(CCK-8、集落形成、划痕愈合、Transwell、流式细胞术)和体内肺转移模型表明敲低SPRY4-IT1抑制增殖、迁移和转移,Western blotting和免疫荧光验证了相关蛋白表达变化。
研究意义
该研究首次揭示SPRY4-IT1在鼻咽癌中的表达和功能,提示SPRY4-IT1可能成为NPC治疗的潜在靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

检测SPRY4-IT1在NPC细胞系中的表达

确定SPRY4-IT1在鼻咽癌细胞系中的表达水平是否异常。

通过qRT-PCR检测7种NPC细胞系(SUNE-1、5-8F、CNE-1、HK1、6-10B、CNE-2、HONE-1)和NP69细胞中SPRY4-IT1的表达。

2

敲低SPRY4-IT1并验证敲低效率

验证siRNA和shRNA敲低SPRY4-IT1的效率。

将si-SPRY4-IT1-1和si-SPRY4-IT1-2转染至6-10B和HONE-1细胞,并用慢病毒建立稳定敲低细胞系。通过qRT-PCR检测敲低效率。

3

检测细胞增殖能力

探究敲低SPRY4-IT1对NPC细胞增殖的影响。

采用CCK-8实验和集落形成实验检测细胞增殖。

4

检测细胞周期分布和凋亡

探讨SPRY4-IT1影响增殖的潜在机制。

通过流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡率,并通过Western blotting检测细胞周期和凋亡相关蛋白表达。

5

检测细胞迁移和体内转移

评估敲低SPRY4-IT1对细胞迁移和体内转移的影响。

通过Transwell和划痕愈合实验检测细胞迁移,通过尾静脉注射建立肺转移模型,计数肺转移结节。

6

检测EMT相关蛋白表达

探究SPRY4-IT1敲低对EMT相关蛋白表达的影响。

通过免疫荧光和Western blotting检测E-cadherin、Vimentin、Snail和Twist1的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
角质形成细胞无血清培养基Invitrogen--
RPMI-1640培养基Thermo Fisher Scientific--
胎牛血清Thermo Fisher Scientific--
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific--
Lipofectamine 3000转染试剂Invitrogen--
siRNA阴性对照Gene Pharma--
靶向SPRY4-IT1的siRNAGene Pharma--
重组慢病毒(LV-SPRY4-IT1 shRNA和LV-scrambled shRNA)Genechem--
嘌呤霉素Invitrogen--
RNA-easy RNA提取试剂Vazyme--
NanoDrop ND2000微量分光光度计Thermo Fisher--
逆转录试剂盒Accurate Biology--
SYBR Green Pro Taq HS试剂Accurate Biology--
AGS9600实时荧光定量PCR仪bioanyu--
细胞计数试剂盒-8MedChemExpress--
结晶紫Sigma Life Science--
Transwell小室Corning Life Sciences--
碘化丙啶BD Biosciences--
异硫氰酸荧光素BD Biosciences--
CytoFLEX流式细胞仪Beckman Coulter--
RIPA裂解液BeyotimeP0013
磷酸酶抑制剂MedChemExpressHY-K0021
蛋白酶抑制剂BeyotimeST506
BCA蛋白定量试剂盒BeyotimeP0010
PVDF膜Merck milliporeISEQ00010
β-actin抗体CST8457
Twist1抗体CST69366
Snail抗体CST3879
cdc2抗体CST9116
p-cdc2抗体CST4539
cyclin B1抗体CST12231
cleaved caspase-3抗体CST9664
PARP抗体CST9532
cleaved PARP抗体CST5625
E-cadherin抗体Abcamab231303
Vimentin抗体Abcamab8978
二抗(#7074或#7076)CST7074
SuperSignal Western印迹增强剂Thermo Fisher46640
Tanon-5200多功能成像系统Tanon--
Triton X-100----
牛血清白蛋白----
荧光二抗(#4410或#4408)CST4410
DAPI----
P250 Flash数字显微镜3DHISTECHP250
GraphPad Prism 8.0----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系来源和培养基成分(NP69使用角质形成细胞无血清培养基,NPC细胞系使用RPMI-1640+10%FBS)
阅读提示:Materials and Methods: Cell culture
细胞转染
siRNA浓度(150 pmol/孔)、转染试剂Lipofectamine 3000(3 μL/孔)、慢病毒MOI=50、嘌呤霉素筛选浓度(3 μg/mL)
阅读提示:Materials and Methods: Cell transfection
细胞增殖检测
CCK-8检测时间点(0、24、48、72、96小时)和细胞数(2×10^3/孔);集落形成实验细胞数(4×10^2/孔)和培养时间(约2周)
阅读提示:Materials and Methods: Cell viability assay
迁移和侵袭检测
Transwell实验细胞数(5×10^4/孔)、孵育时间(24小时);划痕愈合实验细胞数(5×10^3/孔)和记录时间(0、24小时)
阅读提示:Materials and Methods: Transwell assays and Wound healing assay
细胞周期和凋亡检测
细胞固定条件(70%乙醇,-20℃过夜)、PI和FITC染色时间(15分钟)
阅读提示:Materials and Methods: Flow cytometry
蛋白表达检测
抗体稀释度(例如β-actin 1:1000, cyclin B1 1:1000等)、二抗稀释度(1:5000)、封闭条件(5%脱脂牛奶室温1小时)
阅读提示:Materials and Methods: Western blotting assay
动物实验
小鼠品系(BALB/c裸鼠)、性别(雌性)、年龄(5-6周)、注射细胞数(8×10^6/0.2 mL)、观察时间(7周)
阅读提示:Materials and Methods: Animal experiment