检测SPRY4-IT1在NPC细胞系中的表达
确定SPRY4-IT1在鼻咽癌细胞系中的表达水平是否异常。
通过qRT-PCR检测7种NPC细胞系(SUNE-1、5-8F、CNE-1、HK1、6-10B、CNE-2、HONE-1)和NP69细胞中SPRY4-IT1的表达。
Long non-coding RNA SPRY4-IT1 promotes proliferation and metastasis in nasopharyngeal carcinoma cell.
包含体外细胞功能实验(增殖、迁移、凋亡)、分子机制验证(Western blot、免疫荧光)和体内动物转移模型,且具有明确的机制验证。
鼻咽癌细胞系6-10B 鼻咽癌细胞系HONE-1 BALB/c裸鼠肺转移模型
SPRY4-IT1在NPC细胞系中的表达水平(qRT-PCR) siRNA敲低效率及靶序列 CCK-8和集落形成实验中的细胞数量和时间点 Transwell迁移实验的细胞数和时间 流式细胞术检测细胞周期和凋亡的具体方法
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定SPRY4-IT1在鼻咽癌细胞系中的表达水平是否异常。
通过qRT-PCR检测7种NPC细胞系(SUNE-1、5-8F、CNE-1、HK1、6-10B、CNE-2、HONE-1)和NP69细胞中SPRY4-IT1的表达。
验证siRNA和shRNA敲低SPRY4-IT1的效率。
将si-SPRY4-IT1-1和si-SPRY4-IT1-2转染至6-10B和HONE-1细胞,并用慢病毒建立稳定敲低细胞系。通过qRT-PCR检测敲低效率。
探究敲低SPRY4-IT1对NPC细胞增殖的影响。
采用CCK-8实验和集落形成实验检测细胞增殖。
探讨SPRY4-IT1影响增殖的潜在机制。
通过流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡率,并通过Western blotting检测细胞周期和凋亡相关蛋白表达。
评估敲低SPRY4-IT1对细胞迁移和体内转移的影响。
通过Transwell和划痕愈合实验检测细胞迁移,通过尾静脉注射建立肺转移模型,计数肺转移结节。
探究SPRY4-IT1敲低对EMT相关蛋白表达的影响。
通过免疫荧光和Western blotting检测E-cadherin、Vimentin、Snail和Twist1的表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 角质形成细胞无血清培养基 | Invitrogen | -- |
| RPMI-1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| siRNA阴性对照 | Gene Pharma | -- | |
| 靶向SPRY4-IT1的siRNA | Gene Pharma | -- | |
| 重组慢病毒(LV-SPRY4-IT1 shRNA和LV-scrambled shRNA) | Genechem | -- | |
| 嘌呤霉素 | Invitrogen | -- | |
| RNA提取和qRT-PCR | RNA-easy RNA提取试剂 | Vazyme | -- |
| NanoDrop ND2000微量分光光度计 | Thermo Fisher | -- | |
| 逆转录试剂盒 | Accurate Biology | -- | |
| SYBR Green Pro Taq HS试剂 | Accurate Biology | -- | |
| qRT-PCR | AGS9600实时荧光定量PCR仪 | bioanyu | -- |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | MedChemExpress | -- |
| 结晶紫 | Sigma Life Science | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning Life Sciences | -- |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | BD Biosciences | -- |
| 异硫氰酸荧光素 | BD Biosciences | -- | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 磷酸酶抑制剂 | MedChemExpress | HY-K0021 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | ST506 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 | |
| PVDF膜 | Merck millipore | ISEQ00010 | |
| β-actin抗体 | CST | 8457 | |
| Twist1抗体 | CST | 69366 | |
| Snail抗体 | CST | 3879 | |
| cdc2抗体 | CST | 9116 | |
| p-cdc2抗体 | CST | 4539 | |
| cyclin B1抗体 | CST | 12231 | |
| cleaved caspase-3抗体 | CST | 9664 | |
| PARP抗体 | CST | 9532 | |
| cleaved PARP抗体 | CST | 5625 | |
| E-cadherin抗体 | Abcam | ab231303 | |
| Vimentin抗体 | Abcam | ab8978 | |
| 二抗(#7074或#7076) | CST | 7074 | |
| SuperSignal Western印迹增强剂 | Thermo Fisher | 46640 | |
| Tanon-5200多功能成像系统 | Tanon | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 荧光二抗(#4410或#4408) | CST | 4410 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 动物实验 | P250 Flash数字显微镜 | 3DHISTECH | P250 |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养基成分(NP69使用角质形成细胞无血清培养基,NPC细胞系使用RPMI-1640+10%FBS) 阅读提示:Materials and Methods: Cell culture |
| 细胞转染 | siRNA浓度(150 pmol/孔)、转染试剂Lipofectamine 3000(3 μL/孔)、慢病毒MOI=50、嘌呤霉素筛选浓度(3 μg/mL) 阅读提示:Materials and Methods: Cell transfection |
| 细胞增殖检测 | CCK-8检测时间点(0、24、48、72、96小时)和细胞数(2×10^3/孔);集落形成实验细胞数(4×10^2/孔)和培养时间(约2周) 阅读提示:Materials and Methods: Cell viability assay |
| 迁移和侵袭检测 | Transwell实验细胞数(5×10^4/孔)、孵育时间(24小时);划痕愈合实验细胞数(5×10^3/孔)和记录时间(0、24小时) 阅读提示:Materials and Methods: Transwell assays and Wound healing assay |
| 细胞周期和凋亡检测 | 细胞固定条件(70%乙醇,-20℃过夜)、PI和FITC染色时间(15分钟) 阅读提示:Materials and Methods: Flow cytometry |
| 蛋白表达检测 | 抗体稀释度(例如β-actin 1:1000, cyclin B1 1:1000等)、二抗稀释度(1:5000)、封闭条件(5%脱脂牛奶室温1小时) 阅读提示:Materials and Methods: Western blotting assay |
| 动物实验 | 小鼠品系(BALB/c裸鼠)、性别(雌性)、年龄(5-6周)、注射细胞数(8×10^6/0.2 mL)、观察时间(7周) 阅读提示:Materials and Methods: Animal experiment |