代谢组学分析鉴定M1巨噬细胞中天冬氨酸代谢改变
评估M1巨噬细胞极化对天冬氨酸代谢的影响
使用LC-MS分析M0和M1巨噬细胞的代谢物，比较天冬氨酸、天冬酰胺和核苷酸水平；通过qPCR检测相关酶的表达。
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天冬氨酸代谢促进炎症巨噬细胞中IL-1β的产生
Aspartate Metabolism Facilitates IL-1β Production in Inflammatory Macrophages.
实验完整度
高包含体外巨噬细胞实验、代谢组学分析、信号通路抑制剂验证、体内小鼠感染模型和仔猪补充实验，具有多层次功能与机制验证。
主要模型
小鼠腹腔巨噬细胞 小鼠柠檬酸杆菌感染模型 断奶仔猪模型
重点核对
天冬氨酸处理浓度：0.1、1、10 mM LPS和IFN-γ刺激浓度和时间：1 μg/ml LPS，20 ng/ml IFN-γ，15 h 抑制剂处理：PX-478 (10 μM)，MCC-950 (10 μM)，VX-765 (20 μM)，IKK-16 (10 μM) 小鼠感染模型：柠檬酸杆菌DBS100，1×10^8 CFU，口服灌胃 仔猪补充天冬氨酸剂量：0.005%、0.05%、0.5% 基础日粮
摘要
越来越多的证据表明，细胞氨基酸代谢塑造免疫细胞的命运；然而，天冬氨酸代谢是否决定巨噬细胞功能仍然是个谜。在这里，我们发现天冬氨酸代谢中的代谢物在脂多糖（LPS）加干扰素γ（IFN-γ）刺激的巨噬细胞中被耗尽。天冬氨酸促进M1巨噬细胞中白细胞介素-1β（IL-1β）的分泌。机制上，天冬氨酸增强缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和炎症小体的激活，并增加天冬氨酸代谢中代谢物（如天冬酰胺）的水平。有趣的是，天冬酰胺也加速细胞信号通路的激活，并促进巨噬细胞产生炎症细胞因子。此外，天冬氨酸补充增强了小鼠和仔猪中巨噬细胞介导的炎症反应。这些结果揭示了天冬氨酸代谢在指导M1巨噬细胞极化中先前未被表征的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 天冬氨酸代谢是否调控巨噬细胞极化及其潜在机制？
- 核心机制
- 天冬氨酸通过代谢重编程增强HIF-1α和NLRP3炎症小体激活，促进IL-1β分泌；天冬酰胺可能介导此效应，并激活NF-κB、HIF-1α和NLRP3炎症小体。
- 主要证据
- LC-MS代谢组学显示M1巨噬细胞中天冬氨酸代谢物减少；外源天冬氨酸补充促进IL-1β分泌；抑制剂PX-478、MCC-950、VX-765阻断其效应；体内小鼠和仔猪实验显示天冬氨酸增强炎症反应和抗菌能力。
- 研究意义
- 研究揭示了天冬氨酸代谢在调控免疫反应中的新机制，可能为免疫相关疾病的治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外补充天冬氨酸对巨噬细胞极化的影响
验证天冬氨酸对M1巨噬细胞IL-1β分泌和信号通路激活的作用
用不同浓度天冬氨酸处理M1巨噬细胞，检测IL-1β分泌、信号通路蛋白表达，并使用抑制剂验证机制。
天冬氨酸对巨噬细胞代谢组的影响
探究天冬氨酸是否通过重编程细胞代谢促进IL-1β产生
通过LC-MS分析天冬氨酸处理的M1巨噬细胞的代谢物变化，并结合转录和翻译抑制剂验证。
天冬酰胺对巨噬细胞极化的影响
评估天冬氨酸的衍生物天冬酰胺是否介导其作用
用天冬酰胺处理M1巨噬细胞，检测IL-1β分泌和信号通路激活，并使用IKK16和VX-765抑制验证。
体内验证天冬氨酸对巨噬细胞介导炎症反应的影响
验证天冬氨酸在体内是否增强巨噬细胞介导的炎症反应
小鼠感染柠檬酸杆菌后补充天冬氨酸，检测结肠细菌载量和IL-1β水平；仔猪日粮补充天冬氨酸，检测肠道IL-1β和TNF-α表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma | L2630 |
| 干扰素γ | PeproTech | 315-05 | |
| 药物处理 | PX-478 | Selleck Chemicals | -- |
| MCC-950 | Selleck Chemicals | -- | |
| VX-765 | Selleck Chemicals | -- | |
| IKK-16 | Selleck Chemicals | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| RT-qPCR | EZ-press RNA纯化试剂盒 | EZBioscience | B0004D |
| Color逆转录试剂盒 | EZBioscience | A0010CGQ | |
| 2× Color SYBR Green qPCR预混液 | EZBioscience | A0012-R2 | |
| QuantStudio 6实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞因子检测 | IL-1β ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10003 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10002 | |
| 抗体 | 抗IL-1β抗体 | Cell Signaling Technology | 12426s |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2972s | |
| 抗磷酸化mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 5536s | |
| 抗HIF-1α抗体 | Cell Signaling Technology | 14179s | |
| 抗IKK抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-7607 | |
| 抗磷酸化IKK抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-293135 | |
| 抗磷酸化IκB抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-8404 | |
| 抗ASC抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-514414 | |
| 抗IκB抗体 | Proteintech | 51066-1-AP | |
| 抗p65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 60008-1-Ig | |
| 抗磷酸化p65抗体 | Bioss | bs-0982R | |
| 抗NLRP3抗体 | Abcam | ab214185 | |
| 抗caspase-1抗体 | Abcam | ab179515 | |
| 动物实验 | 麦康凯琼脂 | -- | -- |
| 杀菌实验 | 庆大霉素 | -- | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 代谢组学 | 细胞刮刀 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 腹腔巨噬细胞分离与培养 | 小鼠品系、性别、年龄：ICR雌性，6-8周龄；硫代乙醇酸盐注射体积和浓度：2 ml 4%；腹腔灌洗液体积：5 ml PBS；培养条件：DMEM含10% FBS和1%青霉素-链霉素，去除未贴壁细胞时间：3 h 阅读提示：材料与方法“腹腔巨噬细胞分离与培养” |
| 巨噬细胞处理 | LPS和IFN-γ浓度及时间：1 μg/ml LPS，20 ng/ml IFN-γ，15 h；天冬氨酸或天冬酰胺浓度：0.1、1、10 mM；天冬氨酸或天冬酰胺处理时间：15 h；抑制剂浓度及处理时间：PX-478 (10 μM)，MCC-950 (10 μM)，VX-765 (20 μM)，dactinomycin (2 μg/ml)，cycloheximide (10 μM) 处理15 h；IKK-16 (10 μM)预处理20 min 阅读提示：材料与方法“巨噬细胞处理” |
| 细胞因子检测 | ELISA试剂盒品牌和货号：Proteintech #KE10003（IL-1β）和#KE10002（TNF-α）；样本类型：细胞培养上清 阅读提示：材料与方法“细胞因子测量” |
| 代谢组学分析 | 细胞数量：1×10^7/孔；提取溶液：50%甲醇乙腈；匀浆时间：2 min；超声条件：35 Hz，冰水浴10 min；离心：14,500 rpm，4°C，15 min；复溶体积：200 μl 50%甲醇水 阅读提示：材料与方法“代谢物谱分析” |
| 小鼠感染模型 | 小鼠品系和性别：C57雌性，6周龄；感染剂量：1×10^8 CFU柠檬酸杆菌（DBS100）；给菌途径：口服灌胃200 μl PBS；感染时间：10天；天冬氨酸补充：饮水0.5 mg/ml，感染前2周给药 阅读提示：材料与方法“柠檬酸杆菌感染小鼠” |
| 仔猪补充实验 | 仔猪年龄：6周龄；天冬氨酸补充剂量：0.005%、0.05%、0.5%基础日粮；取样时间点：第70天和第142天；每时间点每组取样数：第70天 (n=5)，第142天 (n=6) 阅读提示：材料与方法“仔猪天冬氨酸补充” |