Circ_0124644 Serves as a ceRNA for miR-590-3p to Promote Hypoxia-Induced Cardiomyocytes Injury via Regulating SOX4.
包含临床样本（AMI患者血清）和体外细胞模型（AC16缺氧处理），并通过功能获得/缺失、双荧光素酶、RIP、RNA pull-down等验证机制，证据层级完整。
人心肌细胞系AC16（缺氧处理） AMI患者血清样本 健康对照血清样本
缺氧处理条件：37°C，1% O2和5% CO2，处理24小时 circ_0124644敲低使用sh-circ_0124644（50 nM）转染AC16细胞 miR-590-3p mimic和inhibitor（50 nM）转染 SOX4过表达载体（4.0 μg）转染 所有转染使用Lipofectamine 3000
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证circ_0124644在AMI患者和缺氧诱导的心肌细胞中的表达水平及其稳定性。
采用qRT-PCR检测AMI患者血清和健康对照血清中circ_0124644的表达；在缺氧和常氧处理的AC16细胞中检测circ_0124644表达；通过RNase R assay和Act D assay验证circ_0124644的环状结构稳定性；通过亚细胞定位分析确定其在细胞质和细胞核的分布。
验证circ_0124644敲低是否缓解缺氧诱导的细胞活力下降、凋亡和氧化应激。
将sh-circ_0124644（或sh-NC）转染至AC16细胞，随后进行缺氧处理，检测细胞活力（CCK8）、细胞周期和凋亡（流式）、凋亡相关蛋白（WB）、氧化应激标志物（试剂盒）。
验证circ_0124644是否作为ceRNA海绵吸附miR-590-3p。
使用circBank软件预测结合位点；通过双荧光素酶报告基因实验、RIP实验和RNA pull-down实验验证circ_0124644与miR-590-3p的直接结合；并检测缺氧条件下miR-590-3p的表达以及circ_0124644敲低对其的影响。
验证miR-590-3p过表达是否缓解缺氧诱导的损伤。
将miR-590-3p mimic（或miR-NC）转染至AC16细胞，随后缺氧处理，检测细胞活力、细胞周期、凋亡、凋亡相关蛋白和氧化应激水平。
验证circ_0124644敲低的作用是通过miR-590-3p介导的。
在缺氧诱导的AC16细胞中共转染sh-circ_0124644和anti-miR-590-3p（或anti-NC），检测细胞活力、细胞周期、凋亡、凋亡相关蛋白和氧化应激水平。
验证SOX4是miR-590-3p的直接靶基因。
使用targetscan软件预测SOX4 3'UTR与miR-590-3p的结合位点；通过双荧光素酶报告基因实验验证相互作用；检测缺氧条件下SOX4蛋白表达及miR-590-3p过表达或circ_0124644敲低对SOX4表达的影响；检测AMI患者血清中SOX4蛋白和mRNA水平及其与miR-590-3p、circ_0124644的相关性。
验证SOX4过表达是否逆转miR-590-3p的保护作用。
在AC16细胞中共转染miR-590-3p mimic和SOX4过表达载体（或pcDNA），随后缺氧处理，检测细胞活力、细胞周期、凋亡、凋亡相关蛋白和氧化应激水平。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录试剂盒 | Qiagen | -- | |
| SYBR Green试剂盒 | Vazyme | -- | |
| RNase R assay | RNase R | Geneseed | -- |
| 亚细胞定位分析 | PARIS试剂盒 | Ambion | -- |
| 细胞活力检测 | CCK8溶液 | Apexbio | -- |
| 细胞周期检测 | 细胞周期检测试剂盒 | KeyGen | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗CyclinD1抗体 | Bioss | bs-20596R | |
| 抗Cleaved-caspase3抗体 | Bioss | bs-20364R | |
| 抗SOX4抗体 | Bioss | bs-11208R | |
| 抗β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| 山羊抗兔IgG抗体 | Bioss | bs-0295G | |
| BeyoECL Plus显影液 | Beyotime | -- | |
| 氧化应激标志物检测 | LDH检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| MDA检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| SOD检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| CAT检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | psiCHECK-2载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| RIP实验 | Magna RIP试剂盒 | Millipore | -- |
| RNA pull-down实验 | 链霉亲和素标记磁珠 | Pierce | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0 | GraphPad | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 血清样本采集 | AMI患者和健康对照的纳入标准及排除标准 阅读提示：Materials and Methods - Serum Samples |
| 细胞培养与缺氧处理 | AC16细胞来源、培养基成分、缺氧条件（1% O2, 5% CO2, 37°C, 24小时） 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture and Treatments |
| 细胞转染 | 转染试剂（Lipofectamine 3000）、寡核苷酸浓度（50 nM）、载体用量（4.0 μg） 阅读提示：Materials and Methods - Cell Transfection |
| circ_0124644敲低功能验证 | sh-circ_0124644和sh-NC的使用浓度、缺氧处理时间 阅读提示：Results - Knockdown of circ_0124644...; Figure 2 legend |
| miR-590-3p功能验证 | miR-590-3p mimic和inhibitor的使用浓度 阅读提示：Results - MiR-590-3p Overexpression...; Figure 4 legend |
| SOX4功能验证 | SOX4过表达载体用量（4.0 μg） 阅读提示：Results - SOX4 Overexpression...; Figure 7 legend |
