抑制类固醇5α-还原酶I型通过PI3K/Akt/mTOR通路促进多发性骨髓瘤细胞凋亡和自噬

Suppression of steroid 5α-reductase type I promotes cellular apoptosis and autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway in multiple myeloma.

作者信息Renjie Dou, Jinjun Qian, Wei Wu, Yanxin Zhang, Yuxia Yuan, Mengjie Guo, Rongfang Wei, Shu Yang, Artur Jurczyszyn, Siegfried Janz, Meral Beksac, Chunyan Gu, Ye Yang
PMID33627630
发布时间2021-02-24
DOI10.1038/s41419-021-03510-4

实验完整度

高

包含体外细胞实验、异种移植和5TMM小鼠模型等体内外证据,以及转录组测序、Western blot、流式细胞术等功能验证和机制验证。

主要模型

人骨髓瘤细胞系ARP1和H929 OCI-MY5异种移植小鼠模型 5TMM3VT小鼠骨髓瘤模型

重点核对

SRD5A1敲低使用Dox诱导的shRNA,ARp1和H929细胞 SRD5A1过表达细胞系OCI-MY5-SRD5A1-OE Dutasteride给药剂量:25 mg/kg,腹腔注射,每周三次 自噬抑制剂3-MA处理浓度和时间 凋亡检测:Annexin-V/PI染色,Western blot检测cleaved caspase-3和PARP

摘要

类固醇5α-还原酶I型(SRD5A1)在许多性激素相关癌症中被证实为致癌基因,但其在多发性骨髓瘤(MM)中的作用仍然未知。基于疾病过程中连续MM样本的基因表达谱(GEP),我们发现SRD5A1的异常表达与MM患者的进展和不良预后相关。在本研究中,SRD5A1的致癌作用在人MM细胞系(ARP1和H929)以及异种移植MM模型和5TMM小鼠模型中得到验证。使用MTT和流式细胞术评估在诱导性敲低SRD5A1后MM细胞的增殖、细胞周期和凋亡,敲低通过慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)实现。转录组测序、免疫荧光和Western blot用于研究SRD5A1抑制对细胞凋亡和自噬的影响。机制上,SRD5A1下调同时通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节Bcl-2家族蛋白介导的凋亡和自噬过程。同时,使用自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤)和SRD5A1抑制剂(度他雄胺)评估其抗骨髓瘤效应。因此,我们的结果表明SRD5A1下调同时调节MM细胞中的凋亡和自噬过程。具有双重自噬-凋亡调节作用的SRD5A1可能作为MM进展和预后的生物标志物和潜在靶点。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
SRD5A1在多发性骨髓瘤中是否具有致癌作用及其潜在机制?
核心机制
SRD5A1下调通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导自噬,并同时通过调节Bcl-2家族蛋白促进凋亡。
主要证据
在人MM细胞系中诱导敲低SRD5A1后,细胞增殖受抑、细胞周期阻滞、凋亡增加;RNA-seq显示自噬和凋亡通路富集;Western blot证实自噬标志物和凋亡蛋白变化;异种移植模型显示SRD5A1过表达促进肿瘤生长,Dutasteride治疗延长5TMM小鼠生存期。
研究意义
SRD5A1可能作为MM进展和预后的生物标志物及治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

临床相关性分析

评估SRD5A1在MM患者中的表达与预后的关系

利用TCGA和GEO数据集分析SRD5A1表达水平与多种癌症及MM患者生存期的相关性。

2

体外功能验证

验证敲低SRD5A1对骨髓瘤细胞增殖、周期和凋亡的影响

使用Dox诱导的shRNA敲低SRD5A1,通过MTT、流式细胞术检测细胞增殖、周期和凋亡。

3

体内功能验证

验证SRD5A1过表达对肿瘤生长的影响

将OCI-MY5-SRD5A1-OE和对照细胞皮下注射到NSG小鼠,监测肿瘤生长。

4

机制探索

阐明SRD5A1敲低诱导凋亡和自噬的分子机制

通过RNA-seq、Western blot、免疫荧光和透射电镜检测自噬和凋亡相关蛋白及信号通路。

5

药物干预实验

评估自噬抑制剂和SRD5A1抑制剂对骨髓瘤细胞和小鼠模型的作用

使用3-MA抑制自噬,观察对SRD5A1敲低诱导凋亡的影响;使用Dutasteride抑制SRD5A1,评估其抗骨髓瘤效果。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RPMI-1640培养基Biological Industries--
DMEM培养基Biological Industries--
胎牛血清Biological Industries--
青霉素/链霉素Sigma-Aldrich--
RIPA裂解液Thermo Fisher89900
蛋白酶抑制剂混合物Yeasen20124ES03
PVDF膜MilliporeIPVH00010
超敏ECL检测试剂Yeasen36208ES60
RNase AYeasen10405ES03
碘化丙啶Yeasen40710ES03
Annexin-V-APCBioLegend640941
Flowsight流式细胞仪Merck Millipore--
MTT试剂----
二甲基亚砜----
多西环素----
度他雄胺APExBIOA1659
羟氯喹APExBIOB4874
3-甲基腺嘌呤APExBIOA8353
多柔比星Sigma-AldrichD1515
Caspase-3抗体Cell Signaling Technology9662
Cleaved caspase-3抗体Cell Signaling Technology9661
PARP抗体Cell Signaling Technology9542
Bcl-xl抗体Cell Signaling Technology2762
Bcl-2抗体Cell Signaling Technology2876
Bad抗体Cell Signaling Technology9292
Bax抗体Cell Signaling Technology2774
ATG-5抗体Cell Signaling Technology12994
ATG-7抗体Cell Signaling Technology8558
LC3A/B抗体Cell Signaling Technology12741
Akt抗体Cell Signaling Technology9272
p-Akt (Thr308)抗体Cell Signaling Technology9275
p-mTOR抗体Cell Signaling Technology2971
p-p70S6K (Thr389)抗体Cell Signaling Technology9234
β-actin抗体Cell Signaling Technology4970
SRD5A1抗体Proteintech66329-1-Ig
p70S6K抗体Proteintech14485-1-AP
p-PI3K (Tyr607)抗体AffinityAF3241
mTOR抗体AffinityAF6308
SQSTM1/p62抗体Sigma-AldrichP0067
山羊抗兔IgG/Alexa Fluor 647抗体Biossbs-0295G-AF647
DAPISolarbioC0080
牛血清白蛋白SolarbioA8020
LY294002Cell Signaling Technology9901
Illumina NovaSeq 6000测序仪Illumina--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系:ARP1、OCI-MY5、NCI-H929、5TMM3VT;培养基:RPMI-1640、DMEM;血清:10% FBS;青霉素/链霉素:1%;培养条件:37°C,5% CO2
阅读提示:Methods - Cell lines and cell culture
基因敲低
shRNA序列:TRIPZ载体,Dox诱导;转染效率需通过Western blot验证
阅读提示:Methods - Lentiviral gene transduction
细胞周期与凋亡检测
细胞数量:1×10^6(周期),2×10^5(凋亡);PI浓度:40 μg/mL;Annexin-V-APC染色;处理时间:48小时
阅读提示:Methods - Flow cytometry
细胞活力检测
细胞密度:3000-4000细胞/孔;MTT孵育4小时;OD570测定
阅读提示:Methods - Cell viability assay
体内异种移植模型
细胞数量:1×10^6;小鼠品系:NSG,6-8周龄;n=8;肿瘤直径达15mm时处死;肿瘤体积测量间隔3天
阅读提示:Methods - Myeloma xenograft tumor mouse model
5TMM小鼠模型
细胞数量:1×10^6;小鼠品系:C57BL/KaLwrij,6周龄;n=14;Dutasteride剂量:25 mg/kg,腹腔注射,每周三次;记录因瘫痪导致死亡的时间
阅读提示:Methods - 5TMM mouse model