生物信息学分析
评估TSC22D3在AML中的表达水平及其与预后的关联
利用TCGA和GTEx数据库进行泛癌分析,GEO数据集验证AML、MDS和对照中的表达,并进行差异表达、GO、免疫浸润和GSEA分析。
TSC22D3 as an immune-related prognostic biomarker for acute myeloid leukemia.
包含数据库分析、细胞功能实验(增殖、凋亡、周期)、动物模型(CDX)及机制验证(NF-κB/NLRP3通路)。
Hel细胞 THP1来源的巨噬细胞 BALB/c裸鼠CDX模型 TCGA及GEO数据集
TSC22D3表达水平(RT-qPCR和Western blot) shRNA敲低效率 Ara-c处理浓度(100 nM)和时间 CDX模型小鼠品系(BALB/c裸鼠)及给药方案(20 mg/kg每3天) 流式细胞术检测巨噬细胞极化Marker
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估TSC22D3在AML中的表达水平及其与预后的关联
利用TCGA和GTEx数据库进行泛癌分析,GEO数据集验证AML、MDS和对照中的表达,并进行差异表达、GO、免疫浸润和GSEA分析。
验证TSC22D3对AML细胞增殖、凋亡、细胞周期和药物敏感性的影响
在Hel细胞中敲低TSC22D3,检测细胞增殖、凋亡、细胞周期以及Ara-c处理后的反应。
验证TSC22D3对AML细胞在体内增殖的影响
建立CDX小鼠模型,植入敲低TSC22D3的Hel细胞,并给予Ara-c治疗,观察肿瘤生长。
研究TSC22D3对巨噬细胞极化和浸润的影响
通过THP1细胞诱导分化巨噬细胞,与敲低TSC22D3的肿瘤细胞共培养,检测M1/M2标志物;并用CDX肿瘤组织单细胞悬液分析巨噬细胞浸润。
阐明TSC22D3抑制巨噬细胞极化及炎症反应的分子机制
在敲低TSC22D3的Hel细胞中检测NF-κB和NLRP3通路蛋白表达,以及分泌的IL-1β和IL-18水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | ThermoFisher | 15596018 |
| Fast逆转录试剂盒 | ESscience | RT001 | |
| 2倍Super SYBR Green qPCR预混液(含ROX) | ESscience | QP002 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | CWBIO | CW2383S | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | CWBIO | CW0014S | |
| 12.5% SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒 | EpiZyme | PG113 | |
| PVDF膜 | Biosharp | BS-PVDF-22 | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| 通用抗体稀释液 | EpiZyme | PS119L | |
| 抗TSC22D3抗体 | Signalway Antibody | 39175 | |
| 抗β-Actin抗体 | Signalway Antibody | 52901 | |
| 抗PCNA抗体 | Cell Signaling Technology | 13110 | |
| 抗磷酸化NF-κB p65 (Ser536)抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗磷酸化IKBα (S36)抗体 | Abcam | ab133462 | |
| 抗NLRP3抗体 | Abcam | ab263899 | |
| 抗pro Caspase-1 + p10 + p12抗体 | Abcam | ab179515 | |
| 抗p53抗体 | PTM Biolabs | PTM-6319 | |
| 抗Caspase-1/剪切Caspase-1抗体 | Wanleibio | WL03450 | |
| 抗pro IL-1β抗体 | Wanleibio | WL02257 | |
| 抗TMS1/ASC抗体 | Wanleibio | 02462 | |
| 抗Vinculin抗体 | Wanleibio | 03922 | |
| shRNA敲低 | pLKD-U6-MCS-CMV-EGFP-2A-Puro载体 | Umine-bio | G0202296-1 |
| AgeI-HF限制性内切酶 | NEB | R3552L | |
| EcoRI-HF限制性内切酶 | NEB | R3101V | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0201S | |
| Stbl3感受态细胞 | TSINGKE | TSC-C06 | |
| 无内毒素质粒提取试剂盒 | TIANGEN | DP118-02 | |
| 慢病毒包装 | Opti-MEM培养基 | ThermoFisher | 31985070 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Gibco | C11875500BT |
| DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| 胎牛血清 | WISENT | 086-150 | |
| 青链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 细胞增殖与药物敏感性 | CCK-8试剂盒 | Apex Bio | K1018 |
| 药物处理 | 阿糖胞苷 | Apex BIO | A8405 |
| 凋亡检测 | 7-AAD-APC-Annexin V凋亡检测试剂盒 | Tonbo | 20-6410-KIT |
| 细胞周期分析 | 细胞周期检测试剂盒 | 4Abio | FXP0211 |
| THP1分化 | 佛波酯 | MCE | HY-18739 |
| 重组人IFN-γ蛋白 | NovoProtein | C014 | |
| 脂多糖 | Bioss | bs-8000P | |
| 重组人IL-4蛋白 | NovoProtein | C050 | |
| 重组人IL-13蛋白 | NovoProtein | CC89 | |
| 动物实验 | 基质胶 | CELLada | CELLada-OM-2 |
| 单细胞悬液制备 | I型胶原酶 | Sigma | C0130 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Acmec | D61780 | |
| 红细胞裂解液 | Beyotime | C3702 | |
| 流式细胞术 | 7-AAD活力染色液 | BioLegend | 420404 |
| 抗CD11b抗体 | BioLegend | 101224 | |
| 抗F4/80抗体 | BioLegend | 123107 | |
| 抗CD80抗体 | BioLegend | 104707 | |
| 抗CD206抗体 | BioLegend | 141707 | |
| ELISA | 人IL-18 ELISA试剂盒 | MultiSciences | EK118 |
| 人IL-1β ELISA试剂盒 | MultiSciences | EK101B |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源:KG-1、MV-4-11、OCI-AML3、U937、Hel、THP1、293T;培养基:RPMI或DMEM;血清:10% FBS;青霉素/链霉素浓度:100 U/ml和100 μg/ml;培养条件:37°C、5% CO2。 阅读提示:Methods - Cell lines |
| TSC22D3敲低 | shRNA靶向序列;质粒构建;转染方法(lipofectamine 3000);敲低效率验证。 阅读提示:Methods - Short hairpin RNA (shRNA) knockdown |
| 细胞增殖与药物敏感性 | CCK-8实验接种密度:1×10^4细胞/孔(增殖),5×10^4细胞/孔(活性/EC50);Ara-c浓度:100 nM;处理时间:4天;EC50测定时间:48小时。 阅读提示:Methods - Cell viability assay |
| 凋亡检测 | Ara-c浓度:100 nM;处理时间:2天;细胞密度:1×10^6细胞/孔;染色使用7-AAD-APC-Annexin V试剂盒。 阅读提示:Methods - Annexin V and 7-AAD staining |
| 细胞周期分析 | 细胞同步化:Opti-MEM 24小时;Ara-c浓度:100 nM;处理时间:48小时;检测方法:PI染色。 阅读提示:Methods - Cell cycle analysis |
| THP1分化与共培养 | PMA浓度:185ng/ml;诱导M0时间:6小时;M1极化因子:IFN-γ 20ng/ml、LPS 100ng/ml;M2极化因子:IL-4 20ng/ml、IL-13 20ng/ml;共培养比例:1:1;共培养时间:48小时。 阅读提示:Methods - THP1-induced differentiation macrophages, Co-culture |
| 动物实验 | 小鼠品系:BALB/c裸鼠(4-6周龄雄性);细胞数量:5×10^6/只;注射体积:150μl;Ara-c给药:20 mg/kg,每3天腹腔注射;肿瘤测量频率:每5天;肿瘤体积公式:D*d*H*π/6。 阅读提示:Methods - Mouse models |
| 免疫浸润分析 | 肿瘤组织单细胞悬液制备:胶原酶I浓度1 mg/ml,DNase I浓度100 U/ml;流式抗体:CD11b、F4/80、CD80、CD206;7-AAD使用浓度:1:100。 阅读提示:Methods - Preparation of single-cell suspension of mouse tumor tissue, Macrophages infiltration analysis |
| ELISA | 细胞接种密度:5×10^5细胞/孔;培养时间:4天;检测IL-1β和IL-18浓度。 阅读提示:Methods - Enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) |