TSC22D3作为急性髓系白血病免疫相关预后生物标志物的研究

TSC22D3 as an immune-related prognostic biomarker for acute myeloid leukemia.

作者信息Yang Li, Hanying Huang, Ziang Zhu, Shuzhao Chen, Yang Liang, Lingling Shu
PMID37575189
期刊iScience
发布时间2023-07-22
DOI10.1016/j.isci.2023.107451

实验完整度

包含数据库分析、细胞功能实验(增殖、凋亡、周期)、动物模型(CDX)及机制验证(NF-κB/NLRP3通路)。

主要模型

Hel细胞 THP1来源的巨噬细胞 BALB/c裸鼠CDX模型 TCGA及GEO数据集

重点核对

TSC22D3表达水平(RT-qPCR和Western blot) shRNA敲低效率 Ara-c处理浓度(100 nM)和时间 CDX模型小鼠品系(BALB/c裸鼠)及给药方案(20 mg/kg每3天) 流式细胞术检测巨噬细胞极化Marker

摘要

Acute myeloid leukemia (AML) is the type of hematologic neoplasm most common in adults. Glucocorticoid-induced gene TSC22D3 regulates cell proliferation through its function as a transcription factor. However, there is no consensus on the prognostic and immunoregulatory significance of TSC22D3 in AML. In the present study, we evaluated the correlation between TSC22D3 expression, immunoinfiltration, and prognostic significance in AML. Knockdown of TSC22D3 significantly attenuated the proliferation of Hel cells and increased sensitivity to cytarabine (Ara-c) drugs. Furthermore, TSC22D3 reduced the release of interleukin-1β (IL-1β) by inhibiting the NF-κB/NLRP3 signaling pathway, thereby inhibiting macrophage polarization to M1 subtype, and attenuating the pro-inflammatory tumor microenvironment. In conclusion, this study identified TSC22D3 as an immune-related prognostic biomarker for AML patients and suggested that therapeutic targeting of TSC22D3 may be a potential treatment option for AML through tumor immune escape.

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
TSC22D3在急性髓系白血病(AML)中的表达、预后意义及其对免疫微环境的影响机制是什么?
核心机制
TSC22D3通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路,减少IL-1β的释放,进而抑制巨噬细胞向M1型极化,减轻促炎性肿瘤微环境,促进AML进展。
主要证据
数据库分析显示TSC22D3高表达与不良预后相关;体外实验敲低TSC22D3抑制细胞增殖、增加Ara-c敏感性、促进凋亡并影响细胞周期;动物模型验证敲低TSC22D3抑制肿瘤生长;共培养实验显示敲低TSC22D3促进M1型巨噬细胞极化;Western blot证实激活NF-κB和NLRP3通路。
研究意义
TSC22D3被确定为AML的免疫相关预后生物标志物,并提示靶向TSC22D3可能是通过肿瘤免疫逃逸途径治疗AML的潜在策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

生物信息学分析

评估TSC22D3在AML中的表达水平及其与预后的关联

利用TCGA和GTEx数据库进行泛癌分析,GEO数据集验证AML、MDS和对照中的表达,并进行差异表达、GO、免疫浸润和GSEA分析。

2

体外细胞功能实验

验证TSC22D3对AML细胞增殖、凋亡、细胞周期和药物敏感性的影响

在Hel细胞中敲低TSC22D3,检测细胞增殖、凋亡、细胞周期以及Ara-c处理后的反应。

3

体内动物实验

验证TSC22D3对AML细胞在体内增殖的影响

建立CDX小鼠模型,植入敲低TSC22D3的Hel细胞,并给予Ara-c治疗,观察肿瘤生长。

4

免疫微环境研究

研究TSC22D3对巨噬细胞极化和浸润的影响

通过THP1细胞诱导分化巨噬细胞,与敲低TSC22D3的肿瘤细胞共培养,检测M1/M2标志物;并用CDX肿瘤组织单细胞悬液分析巨噬细胞浸润。

5

机制研究

阐明TSC22D3抑制巨噬细胞极化及炎症反应的分子机制

在敲低TSC22D3的Hel细胞中检测NF-κB和NLRP3通路蛋白表达,以及分泌的IL-1β和IL-18水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
TRIzol试剂ThermoFisher15596018
Fast逆转录试剂盒ESscienceRT001
2倍Super SYBR Green qPCR预混液(含ROX)ESscienceQP002
RIPA裂解液----
磷酸酶抑制剂混合物CWBIOCW2383S
BCA蛋白定量试剂盒CWBIOCW0014S
12.5% SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒EpiZymePG113
PVDF膜BiosharpBS-PVDF-22
PVDF膜Merck MilliporeIPVH00010
通用抗体稀释液EpiZymePS119L
抗TSC22D3抗体Signalway Antibody39175
抗β-Actin抗体Signalway Antibody52901
抗PCNA抗体Cell Signaling Technology13110
抗磷酸化NF-κB p65 (Ser536)抗体Cell Signaling Technology3033
抗磷酸化IKBα (S36)抗体Abcamab133462
抗NLRP3抗体Abcamab263899
抗pro Caspase-1 + p10 + p12抗体Abcamab179515
抗p53抗体PTM BiolabsPTM-6319
抗Caspase-1/剪切Caspase-1抗体WanleibioWL03450
抗pro IL-1β抗体WanleibioWL02257
抗TMS1/ASC抗体Wanleibio02462
抗Vinculin抗体Wanleibio03922
pLKD-U6-MCS-CMV-EGFP-2A-Puro载体Umine-bioG0202296-1
AgeI-HF限制性内切酶NEBR3552L
EcoRI-HF限制性内切酶NEBR3101V
T4 DNA连接酶NEBM0201S
Stbl3感受态细胞TSINGKETSC-C06
无内毒素质粒提取试剂盒TIANGENDP118-02
Opti-MEM培养基ThermoFisher31985070
Lipofectamine 3000转染试剂InvitrogenL3000015
RPMI培养基GibcoC11875500BT
DMEM培养基GibcoC11995500BT
胎牛血清WISENT086-150
青链霉素Gibco15140122
CCK-8试剂盒Apex BioK1018
阿糖胞苷Apex BIOA8405
7-AAD-APC-Annexin V凋亡检测试剂盒Tonbo20-6410-KIT
细胞周期检测试剂盒4AbioFXP0211
佛波酯MCEHY-18739
重组人IFN-γ蛋白NovoProteinC014
脂多糖Biossbs-8000P
重组人IL-4蛋白NovoProteinC050
重组人IL-13蛋白NovoProteinCC89
基质胶CELLadaCELLada-OM-2
I型胶原酶SigmaC0130
脱氧核糖核酸酶IAcmecD61780
红细胞裂解液BeyotimeC3702
7-AAD活力染色液BioLegend420404
抗CD11b抗体BioLegend101224
抗F4/80抗体BioLegend123107
抗CD80抗体BioLegend104707
抗CD206抗体BioLegend141707
人IL-18 ELISA试剂盒MultiSciencesEK118
人IL-1β ELISA试剂盒MultiSciencesEK101B

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系来源:KG-1、MV-4-11、OCI-AML3、U937、Hel、THP1、293T;培养基:RPMI或DMEM;血清:10% FBS;青霉素/链霉素浓度:100 U/ml和100 μg/ml;培养条件:37°C、5% CO2。
阅读提示:Methods - Cell lines
TSC22D3敲低
shRNA靶向序列;质粒构建;转染方法(lipofectamine 3000);敲低效率验证。
阅读提示:Methods - Short hairpin RNA (shRNA) knockdown
细胞增殖与药物敏感性
CCK-8实验接种密度:1×10^4细胞/孔(增殖),5×10^4细胞/孔(活性/EC50);Ara-c浓度:100 nM;处理时间:4天;EC50测定时间:48小时。
阅读提示:Methods - Cell viability assay
凋亡检测
Ara-c浓度:100 nM;处理时间:2天;细胞密度:1×10^6细胞/孔;染色使用7-AAD-APC-Annexin V试剂盒。
阅读提示:Methods - Annexin V and 7-AAD staining
细胞周期分析
细胞同步化:Opti-MEM 24小时;Ara-c浓度:100 nM;处理时间:48小时;检测方法:PI染色。
阅读提示:Methods - Cell cycle analysis
THP1分化与共培养
PMA浓度:185ng/ml;诱导M0时间:6小时;M1极化因子:IFN-γ 20ng/ml、LPS 100ng/ml;M2极化因子:IL-4 20ng/ml、IL-13 20ng/ml;共培养比例:1:1;共培养时间:48小时。
阅读提示:Methods - THP1-induced differentiation macrophages, Co-culture
动物实验
小鼠品系:BALB/c裸鼠(4-6周龄雄性);细胞数量:5×10^6/只;注射体积:150μl;Ara-c给药:20 mg/kg,每3天腹腔注射;肿瘤测量频率:每5天;肿瘤体积公式:D*d*H*π/6。
阅读提示:Methods - Mouse models
免疫浸润分析
肿瘤组织单细胞悬液制备:胶原酶I浓度1 mg/ml,DNase I浓度100 U/ml;流式抗体:CD11b、F4/80、CD80、CD206;7-AAD使用浓度:1:100。
阅读提示:Methods - Preparation of single-cell suspension of mouse tumor tissue, Macrophages infiltration analysis
ELISA
细胞接种密度:5×10^5细胞/孔;培养时间:4天;检测IL-1β和IL-18浓度。
阅读提示:Methods - Enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa)