检测CSBF在银屑病中的表达
明确CSBF在银屑病皮损和血清中的表达水平及其细胞来源。
通过免疫组化、ELISA、公共微阵列数据和scRNA-seq数据分析检测CSBF在银屑病患者和IMQ诱导小鼠模型中的表达，并在HaCaT细胞中验证IL-17A和TNF-α对其表达的影响。
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细胞因子CSBF通过SUSD2-ACT1抑制角质形成细胞中IL-17A和TNF-α炎症通路并缓解IMQ诱导的银屑病
The cytokine CSBF inhibits the IL-17A and TNF-α inflammatory pathways via SUSD2-ACT1 in keratinocytes and alleviates IMQ-induced psoriasis
实验完整度
高包含患者样本、细胞系、原代角质形成细胞、基因敲除小鼠、骨髓嵌合体、重组蛋白治疗、scRNA-seq及质谱等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
IMQ诱导的银屑病小鼠模型（C57BL/6J和BALB/c） HaCaT细胞 原代小鼠角质形成细胞 Csbf-/-和Susd2-/-小鼠
重点核对
CSBF重组蛋白的给药剂量为50 μg/kg（腹腔注射） IL-17A和TNF-α的刺激浓度分别为100 ng/mL和50 ng/mL IMQ模型采用5% IMQ乳膏，每日45 mg，连续5天 siRNA敲低SUSD2或ACT1的效率 IL-17A/TNF-α刺激时间点为30分钟或60分钟
摘要
角质形成细胞中炎症信号通路的过度激活对银屑病皮肤炎症至关重要，但其调控机制尚不完全清楚。在此，我们证明细胞因子CSBF抑制IL-17A和TNF-α（IL-17A/TNF-α）在角质形成细胞中诱导的单独及协同促炎信号，在银屑病炎症中发挥保护作用。银屑病患者皮损和血清中CSBF的表达增加，且IL-17A/TNF-α增强其产生。Csbf缺失加剧了IMQ诱导的银屑病样皮肤炎症，并导致角质形成细胞中IL-17A/TNF-α信号通路的过度激活。CSBF蛋白通过受体SUSD2显著改善银屑病表现并抑制IL-17A/TNF-α信号传导。机制上，CSBF-SUSD2与TRAF6和TNFR1竞争与ACT1的相互作用，抑制IL-17A/TNF-α信号通路。总之，抗炎细胞因子CSBF通过靶向角质形成细胞，有可能成为银屑病的治疗选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CSBF在银屑病皮肤炎症中的确切功能和机制是什么？
- 核心机制
- CSBF通过其受体SUSD2，与ACT1的N端TRAF结合域相互作用，竞争性阻断ACT1与TRAF6和TNFR1的结合，从而抑制IL-17A/TNF-α信号通路。
- 主要证据
- 在HaCaT细胞、原代角质形成细胞中，CSBF抑制IL-17A/TNF-α诱导的p65和p38磷酸化及趋化因子表达；在Csbf-/-和Susd2-/-小鼠中，CSBF缺失加重IMQ诱导的皮肤炎症，而重组CSBF蛋白可缓解症状，这些作用依赖于SUSD2和ACT1。
- 研究意义
- CSBF作为内源性抗炎细胞因子，通过靶向角质形成细胞抑制IL-17A/TNF-α信号，为银屑病提供了潜在的治疗策略，并加深了对IL-17A/TNF-α信号调控机制的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CSBF在IMQ诱导银屑病中的保护作用
评估CSBF缺乏或补充对IMQ诱导银屑病样炎症的影响。
使用Csbf-/-和WT小鼠建立IMQ模型，比较皮损严重程度、表皮厚度和炎症细胞浸润；给予重组mCSBF蛋白观察治疗效果。
确定CSBF抑制IL-17A/TNF-α信号通路
探究CSBF对角质形成细胞中IL-17A/TNF-α信号通路的影响。
在Csbf-/-和WT原代角质形成细胞及HaCaT细胞中，检测IL-17A/TNF-α单独或协同刺激下的p65、p38磷酸化及趋化因子表达，并观察CSBF预处理的影响。
鉴定SUSD2为CSBF的功能受体
确定介导CSBF在角质形成细胞中效应的受体。
通过亲和纯化-质谱鉴定与CSBF结合的蛋白，并通过siRNA敲低和Susd2-/-小鼠验证SUSD2在CSBF功能中的必要性。
阐明CSBF-SUSD2抑制IL-17A/TNF-α信号的分子机制
揭示CSBF-SUSD2复合物抑制IL-17A/TNF-α信号通路的具体分子机制。
通过免疫共沉淀验证CSBF-SUSD2与ACT1的相互作用，以及ACT1与TRAF6、TNFR1的相互作用；使用ACT1截短突变体和SUSD2胞内段缺失突变体定位关键结构域。
评估CSBF的体内治疗效果和安全性
验证CSBF蛋白在另一个遗传背景的小鼠模型中的治疗效果和安全性。
在BALB/c小鼠IMQ模型中给予不同剂量mCSBF，评估皮肤炎症改善情况、主要器官组织学及血清生化指标，并与抗IL-17A中和抗体比较疗效。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | SH30022.01 |
| RPMI-1640培养基 | HyClone | SH30027.01 | |
| SMM 293-T II表达培养基 | Sino Biological | M293TII-1L | |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | 13778150 |
| jetPRIME转染试剂 | Polyplus | 101000046 | |
| PEI转染试剂 | MCE | HY-K2014 | |
| 重组蛋白纯化 | HisTrap Excel层析柱 | Cytiva | 29048586 |
| ÄKTA go层析系统 | Cytiva | -- | |
| 离心过滤器（30 kDa） | Millipore | -- | |
| 离心过滤器（3 kDa） | Millipore | -- | |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | A55864 | |
| 考马斯亮蓝染色 | Solarbio | P1305 | |
| IMQ诱导银屑病模型 | 咪喹莫特乳膏（Aldara） | 3M Health Care | H20160079 |
| IL-17A中和抗体 | eBioscience | 16-7173-85 | |
| 原代角质形成细胞分离 | 分散酶II | Sigma-Aldrich | D4693-1G |
| 原代角质形成细胞培养 | 154CF完全培养基 | Gibco | M154CF500 |
| 人角质形成细胞生长添加剂 | Gibco | S0015 | |
| 细胞刺激 | 重组小鼠IL-17A | PeproTech | 210-17 |
| 重组小鼠TNF-α | PeproTech | 315-01A | |
| 重组人IL-17A | PeproTech | 200-17 | |
| 重组人TNF-α | PeproTech | 300-01A | |
| 流式细胞术 | 脱氧核糖核酸酶I | Solarbio | D8071 |
| 胶原酶D | Roche | 11088866001 | |
| Percoll分离液 | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Zombie Aqua可固定活力染料试剂盒 | BioLegend | 423101 | |
| 抗CD45抗体 | BioLegend | 103128, | |
| 抗CD11c抗体 | BioLegend | 117329, | |
| 抗CD11b抗体 | BioLegend | 101206 | |
| 抗Ly6G抗体 | BioLegend | 164506, | |
| 抗F4/80抗体 | BioLegend | 123118, | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Gibco | 15596018 |
| 逆转录试剂盒 | TransGen | AU341-02 | |
| 蛋白质印迹和免疫沉淀 | 硝酸纤维素膜 | Cytiva | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11697498001 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | 4906845001 | |
| Protein G琼脂糖珠 | Cytiva | 17061801 | |
| 亲和免疫沉淀 | 抗FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| 结合实验 | 3×Flag多肽 | Sigma-Aldrich | F4799 |
| 亲和纯化 | 链霉亲和素磁珠 | Vazyme | N512-01 |
| 质谱分析 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| Vivacon 500过滤管 | Sartorius Stedim Biotech | VNO1HO2 | |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪（配备FAIMS Pro） | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| IMQ诱导银屑病模型 | IMQ乳膏剂量：45 mg，每日一次，连续5天；小鼠品系和年龄：9-12周龄C57BL/6J或BALB/c；mCSBF给药剂量：50 μg/kg腹腔注射；抗IL-17A抗体剂量：10 mg/kg腹腔注射（第一天） 阅读提示：Materials and methods: Imiquimod (IMQ)-induced psoriasis-like skin inflammation model |
| 细胞刺激实验 | IL-17A和TNF-α浓度：IL-17A为100 ng/mL，TNF-α为50 ng/mL；hCSBF预处理时间和浓度：100 ng/mL预处理5小时；刺激时间：30分钟（信号通路蛋白）、24小时（基因表达） 阅读提示：Materials and methods: RNA isolation and quantitative RT‒PCR; Western blot and immunoprecipitation (IP) |
| 原代角质形成细胞分离和培养 | 新生小鼠年龄：1-3天；Dispase II浓度：1 mg/mL；0.05%胰蛋白酶消化，37°C，10分钟；细胞接种密度：1×10^6细胞/孔（6孔板） 阅读提示：Materials and methods: Primary keratinocyte isolation and culture |
| 受体功能验证 | SUSD2 siRNA序列（siSUSD2-1和siSUSD2-2）；ACT1 siRNA序列（siACT1-1和siACT1-2）；转染试剂：Lipofectamine RNAiMAX 阅读提示：Materials and methods: Transfection; Results: SUSD2 is the functional receptor of CSBF...; The CSBF-SUSD2-mediated suppression... |
| 蛋白质相互作用分析 | 细胞裂解缓冲液成分：30 mM Tris (pH 7.4), 120 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 10 mM chloroacetamide, 1% DDM, 蛋白酶和磷酸酶抑制剂；免疫沉淀抗体用量：2 μg；hCSBF预处理浓度和时间：100 ng/mL，5小时；刺激时间：30分钟 阅读提示：Materials and methods: Western blot and immunoprecipitation (IP); Results: The CSBF-SUSD2-mediated suppression... |