PADI4诱导系统的建立与p53结合分析
确定PADI4表达是否影响p53在染色质上的定位
构建tet诱导PADI4、D350A和PADI4 KO的HCT116和M93-047细胞系，用nutlin和doxycycline处理，进行p53 ChIP-seq，比较p53结合位点的变化。
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靶向瓜氨酸化使p53能够结合非经典位点
Targeted citrullination enables p53 binding to non-canonical sites.
实验完整度
高包含体外瓜氨酸化实验、细胞系诱导模型、小鼠组织验证、ChIP-seq、CUT&Tag、转录组分析等多层级证据，并包含功能验证（DNA结合、转录活性、凋亡）。
主要模型
HCT116结直肠癌细胞系（tet诱导PADI4/D350A/KO） M93-047黑色素瘤细胞系（tet诱导PADI4/D350A/KO） H1299肺癌细胞系（转染p53和PADI4） C57BL/6小鼠（野生型和PADI4敲除，γ辐射模型）
重点核对
细胞系中PADI4的可诱导表达（tet系统）及活性确认（瓜氨酸化组蛋白） p53瓜氨酸化位点（R306和R363）的鉴定（体外LC-MS/MS和体内IP-MS） PADI4表达对p53染色质结合位点的影响（ChIP-seq和CUT&Tag） p53与ETS因子ELF2的相互作用增强（proximity ligation assay）
摘要
TP53编码转录因子p53，它在应激反应中结合多种靶基因。p53的激活导致高度特异性的转录反应，但p53对启动子选择性的调控尚不清楚。在此，我们报告p53的序列特异性结合受其靶基因和结合伴侣PADI4的调控。PADI4通过一种称为瓜氨酸化的过程，酶促地将肽基精氨酸转化为肽基瓜氨酸。我们显示PADI4在体外瓜氨酸化p53的C末端，并确认了在细胞和小鼠组织中的两个瓜氨酸化事件（R306，R363）。ChIP-seq揭示PADI4表达导致p53从一部分经典结合位点重新定向到与ETS转录因子相关的靶基因。使用瓜氨酸化特异性p53抗体的染色质分析支持这一结论。这些发现将瓜氨酸化与p53功能联系起来，并说明像PADI4这样的染色质修饰因子如何引导p53的转录反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究探讨PADI4通过瓜氨酸化调控p53的启动子选择机制，以及这一修饰如何影响p53的转录反应和肿瘤抑制功能。
- 核心机制
- PADI4在p53的C末端（R306和R363位点）进行瓜氨酸化，改变p53的寡聚化和DNA结合能力，使其从经典p53结合位点重新定位至ETS转录因子结合基序，并增强p53与ETS家族成员ELF2的相互作用，从而重定向p53的转录程序。
- 主要证据
- 体外瓜氨酸化实验结合LC-MS/MS鉴定出p53的R306和R363位点；ChIP-seq和CUT&Tag显示PADI4表达导致p53结合位点的重分布，富集于ETS基序；转录组分析显示基因表达向干扰素反应和氧化磷酸化通路转变；功能实验表明p53与ELF2相互作用增强。
- 研究意义
- 作者提出PADI4通过瓜氨酸化调控p53靶基因特异性，将瓜氨酸化与p53功能联系起来，并提示p53-PADI4-ELF2轴可能成为肿瘤抑制的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
p53瓜氨酸化的体内外验证
验证PADI4是否直接瓜氨酸化p53并确定位点
体外用重组PADI4和p53进行瓜氨酸化反应，通过LC-MS/MS鉴定瓜氨酸化位点；在tet-PADI4细胞中免疫沉淀p53进行质谱分析，并生成特异性抗体进行检测。
瓜氨酸化对p53功能和相互作用的影响
探究瓜氨酸化如何影响p53的DNA结合、转录活性及蛋白相互作用
通过BMH交联分析p53寡聚化，ELISA检测p53 DNA结合活性，荧光素酶报告基因检测转录活性，免疫沉淀-质谱和邻近连接分析检测p53与ETS因子（特别是ELF2）的相互作用。
转录组分析
评估PADI4表达对p53介导的转录程序的影响
对HCT116和M93-047 tet-PADI4细胞进行RNA-seq，比较nutlin和nutlin+doxycycline条件下的基因表达差异，并进行通路富集分析。
染色质上瓜氨酸化p53的定位
确认瓜氨酸化p53是否结合于p53-PADI4共定位的靶基因
使用CUT&Tag技术检测总p53和瓜氨酸化p53（cit306）在基因组上的结合位置，并进行基序分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与诱导 | 多西环素 | Thermo Fisher Scientific | J60422-14 |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Lipofectamine LTX及Plus试剂 | Invitrogen | 15338-100 | |
| 细胞培养与处理 | Nutlin-3a | Sigma-Aldrich | SML0580 |
| 依托泊苷 | SelleckChem | S1225 | |
| 阿霉素 | Cayman Chemical | 15007 | |
| 5-氟尿嘧啶 | Sigma-Aldrich | F6627 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Cell Signaling Technology | 9806 |
| PVDF膜 | Sigma-Aldrich | IPVH00010 | |
| ECL Western印迹底物 | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| 抗p53抗体（DO1） | Santa Cruz Biotechnology | sc-126 | |
| 抗p53抗体（1C12） | Cell Signaling Technology | 2524 | |
| 抗瓜氨酸抗体（克隆F95） | Millipore Sigma | MABN328 | |
| 抗PADI4抗体 | Antibodies online | ABIN2856939 | |
| 免疫沉淀 | Protein G Dynabeads磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10004D |
| 抗FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 | |
| FLAG肽 | Sigma-Aldrich | F3290 | |
| 质谱分析 | 测序级修饰胰蛋白酶 | -- | -- |
| 胰凝乳蛋白酶 | -- | -- | |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Nano-ACQUITY超高效液相色谱系统 | Waters | -- | |
| Orbitrap Astral质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Vanquish Neo超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ChIP-seq | 甲醛 | Sigma-Aldrich | 252549 |
| 乙二醇双（琥珀酰亚胺琥珀酸酯） | Thermo Fisher Scientific | 21565 | |
| Covaris S220超声破碎仪 | Covaris | -- | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒（Illumina） | New England Biolabs | E7645L | |
| Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| Zymo ChIP DNA纯化浓缩试剂盒 | Zymo Research | D5205 | |
| Illumina NextSeq 2000测序仪 | Illumina | -- | |
| CUT&Tag | CUTANA CUT&Tag试剂盒 | EpiCypher | 14-1102 |
| 抗H3K27me3抗体 | Abcam | ab195477 | |
| 正常兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| RNA-seq | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| QuantSeq FWD文库制备试剂盒 | Lexogen | -- | |
| NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | 高效率cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4368814 |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 转录因子活性测定 | TransAM p53转录因子活性检测试剂盒 | Active Motif | 41196 |
| 荧光素酶报告基因 | 萤火虫荧光素酶活性快速检测试剂盒 | Promega | E1910 |
| pGL4.38[luc2P p53 RE Hygro]质粒 | Promega | E3651 | |
| 邻近连接分析 | Duolink原位红色检测起始试剂盒（小鼠/兔） | Millipore Sigma | DUO92101 |
| 免疫组织化学 | VECTASTAIN Elite ABC HRP试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6100 |
| DAB底物试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Hamamatsu Nanozoomer S60玻片扫描仪 | Hamamatsu | -- | |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | Thermo Fisher Scientific | BMS500PI |
| FACSCelesta流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 体外瓜氨酸化 | 重组PADI4蛋白 | Cayman Chemicals | 25915 |
| 重组p53蛋白 | Active Motif | 81091 | |
| GSK484（PADI4抑制剂） | MedChem Express | HY-100514 | |
| 重组单核小体 | Active Motif | 81071 | |
| 细胞周期分析 | 核糖核酸酶A | Thermo Fisher Scientific | AM2271 |
| 细胞培养与诱导 | 聚凝胺 | Santa Cruz Biotechnology | 28728-55-4 |
| 潮霉素B | Corning | 30-240-CR | |
| 免疫印迹 | BCA蛋白定量试剂盒 | BioRad | 5000001 |
| 抗CRIP2抗体 | ProteinTech | 14801-1-AP | |
| 抗裂解Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗裂解Lamin A抗体 | Cell Signaling Technology | 2035 | |
| 抗MDM2抗体 | Cell Signaling Technology | 86934 | |
| 抗p21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 诱导细胞系的建立 | tet诱导PADI4/D350A/KO的克隆筛选及doxycycline浓度（10-100ng/mL） 阅读提示：STAR Methods - Generation of cell lines |
| p53激活与PADI4诱导 | Nutlin-3a浓度（10μM）和doxycycline浓度（50ng/mL）及处理时间（24小时） 阅读提示：STAR Methods - Cell Culture Experiments and Treatment |
| 体外瓜氨酸化实验 | 重组PADI4和p53的浓度、钙离子浓度（10mM）、反应时间（1小时）及抑制剂GSK484的浓度 阅读提示：STAR Methods - In vitro citrullination assay |
| 质谱鉴定瓜氨酸化位点 | 蛋白消化方法（trypsin/chymotrypsin）、质谱仪型号和数据采集参数 阅读提示：STAR Methods - LC MS/MS analysis for identification of citrullination residues |
| ChIP-seq实验 | 抗体使用、交联条件（EGS和甲醛）、超声条件（Covaris S220）及数据分析参数（MACS2、HOMER） 阅读提示：STAR Methods - Chromatin immunoprecipitation-sequencing |
| CUT&Tag实验 | 抗体选择（抗p53和抗p53 cit306）、CUTANA试剂盒操作及测序深度（10 million reads） 阅读提示：STAR Methods - CUT&Tag |
| RNA-seq实验 | RNA提取方法（RNeasy）、文库制备试剂盒（QuantSeq）及生物重复数（3个） 阅读提示：STAR Methods - 3’mRNA Quantseq (RNA-seq) |
| 邻近连接分析 | 抗体组合（p53 DO-1和ELF2）及Duolink试剂盒操作 阅读提示：STAR Methods - Immunofluorescence and Proximity Ligation Assay |