mAb 1871的广谱结合与中和活性测定
评估mAb 1871对多种β-CoV刺突蛋白的结合能力及对SARS-CoV-2假病毒的中和效力。
使用生物层干涉技术检测mAb 1871与SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS、HKU-1、OC43等全长刺突蛋白及S2亚单位的结合，并通过假病毒中和实验测定对SARS-CoV、SARS-CoV-2野生型及Alpha、Beta变体的中和IC50。
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靶向冠状病毒刺突蛋白S2亚单位的人源抗体通过Fc效应功能介导保护作用
Human antibody targeting of coronavirus spike S2 subunit is associated with protection mediated by Fc effector functions.
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、X射线晶体学、生物层干涉、假病毒中和、细胞吞噬、小鼠攻毒模型等，证据层级丰富。
主要模型
OC43 S2亚单位蛋白（残基757-1291，C端T4 foldon三聚化结构域） K18-hACE2/hFcRn双转基因小鼠 293T细胞（用于产生假病毒） 293-ACE2细胞（用于中和实验）
重点核对
mAb 1871抗体（IgG1和IgG1 EL变体）的氨基酸序列 OC43 S2抗原构建体（残基757-1291） K18-hACE2/hFcRn双转基因小鼠模型 SARS-CoV-2 USA-WA1/2020病毒株，1×10^4 PFU攻毒剂量 mAb给药剂量1.5 mg/kg
摘要
在过去的二十年中，β冠状病毒（β-CoVs）引起了两次流行病和一次大流行，并且通过人畜共患传播仍然是未来暴发的高风险，这凸显了对广泛的生物医学对策的需求。在这里，我们描述了一种恢复期人源单克隆抗体（mAb 1871），它靶向冠状病毒刺突蛋白的S2亚单位，具有广泛的β-CoVs结合和sarbecovirus中和活性。冷冻电子显微镜分析显示，mAb 1871结合S2亚单位的上游螺旋，与部分保守的残基相互作用，为其交叉反应性提供了分子基础。尽管效力低于靶向受体结合域的抗体——针对野生型SARS-CoV-2的中和效力比紧急使用授权的靶向受体结合域（RBD）的Pemgarda mAb低约500倍——mAb 1871在小鼠模型中提供了保护效力。值得注意的是，Fc效应功能对其体内保护至关重要。这项研究进一步强调了S2导向抗体对体内保护的Fc依赖性，并确定了S2亚单位中的一个保守表位作为广泛β-CoVs对策的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- S2亚单位靶向抗体mAb 1871的分子结合机制及其体内保护是否依赖Fc效应功能？
- 核心机制
- mAb 1871结合S2亚单位上游螺旋表位，该表位在预融合构象中不可及，仅在刺突发生构象变化后暴露，从而可能干扰膜融合过程。其体内保护主要依赖Fc效应功能，而非强效中和。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示mAb 1871结合OC43 S2亚单位上游螺旋，mAb 1871减Fc受体结合的LALA-PG突变体（IgG1 EL）完全丧失ADCP活性，并在小鼠攻毒模型中保护率从60%降至20%。
- 研究意义
- 研究揭示S2亚单位上游螺旋是一个保守表位，可作为泛β-CoV治疗和疫苗设计的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
OC43 S2亚单位与Fab 1871复合物的冷冻电镜结构解析
确定mAb 1871在S2亚单位上的确切表位及其结合模式。
表达并纯化OC43 S2亚单位（残基757-1291）与Fab 1871复合物，通过冷冻电镜单颗粒分析获得2.6 Å分辨率结构，并与SARS-CoV-2及SARS-CoV的postfusion结构比对。
Fab 1871的X射线晶体结构解析
获得游离Fab结构以辅助冷冻电镜模型的构建。
将纯化的1871 Fab浓缩至5 mg/mL，采用坐滴气相扩散法筛选结晶条件，在0.1 M醋酸钠pH 4.6、3.5 M甲酸钠条件下获得晶体，收集X射线衍射数据并解析至2.5 Å分辨率。
结合表位验证及保守性分析
验证结构预测的表位，并评估其在不同β-CoV中的保守性。
通过生物层干涉检测mAb 1871 IgG和Fab与12、32、43氨基酸残基上游螺旋肽段的结合；使用Consurf分析不同β-CoV序列中上游螺旋表位的保守程度。
评估Fc效应功能对体内保护作用的影响
检验mAb 1871的保护作用是否依赖于FcγR结合和ADCP等效应功能。
构建IgG1 EL突变体（L234A/L235A/P329G）以消除FcγR结合，通过BLI验证其与鼠FcγR结合丧失，ADCP实验测定吞噬活性；在K18-hACE2/hFcRn双转基因小鼠模型中比较IgG1和IgG1 EL的保护效果。
针对Omicron变体的中和活性丧失及机制分析
探究mAb 1871对Omicron变体失去中和活性的原因。
通过假病毒中和实验测定mAb 1871对Omicron BA.1和BA.5的IC50，并进行结构建模分析N842K突变可能导致的位阻效应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
结构预测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | pcDNA3.4表达载体 | Geneart (Life Technologies) | -- |
| HEK-293F细胞 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences | -- | |
| 蛋白纯化 | KappaSelect亲和树脂 | Cytiva | -- |
| 蛋白A亲和层析 | Cytiva | -- | |
| MonoS阳离子交换柱 | Cytiva | -- | |
| Superdex200尺寸排阻色谱柱 | Cytiva | -- | |
| 抗原表达与纯化 | HEK-293S (GnT I-/-)细胞 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗原纯化 | HisTrap亲和层析柱 | Cytiva | -- |
| Superose 6尺寸排阻色谱柱 | Cytiva | -- | |
| HisTrap-NiNTA柱 | Cytiva | -- | |
| Superdex 200 increase柱 | Cytiva | -- | |
| 生物层干涉实验 | Octet Red96生物层干涉仪 | Sartorius ForteBio | -- |
| Ni-NTA生物传感器 | Sartorius ForteBio | -- | |
| SAX生物传感器 | Sartorius ForteBio | -- | |
| SARS-CoV刺突蛋白 | Sino Biological | 40634-V08B | |
| MERS刺突蛋白 | Sino Biological | 40069-V08B | |
| HKU-1刺突蛋白 | Sino Biological | 40606-V08B | |
| OC-43刺突蛋白 | Sino Biological | 40607-V08B | |
| HCoV-229E刺突蛋白 | Sino Biological | 40605-V08B | |
| SARS-CoV S2亚单位 | Sino Biological | 40150-V08B | |
| SARS-CoV-2 S2亚单位 | Sino Biological | 40590-V08B | |
| MERS S2亚单位 | Sino Biological | 40070-V08B | |
| 上游螺旋肽段 | GenScript | -- | |
| 结晶实验 | MCSG1稀疏矩阵筛选试剂盒 | Microlytic | -- |
| 蛋白处理 | 内切糖苷酶H | New England Biolabs | -- |
| 冷冻电镜 | Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Falcon 4相机 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 假病毒中和实验 | 293T细胞 | ATCC | -- |
| 293-ACE2细胞 | BEI Resources | NR52511 | |
| 慢病毒载体 | BEI Resources | NR52516 | |
| SARS-CoV-2/WIV04/2019野生型刺突蛋白 | BEI Resources | NR52516 | |
| Omicron BA.5刺突蛋白 | GeneArt (Thermo Fisher Scientific) | -- | |
| ADCP实验 | FcγRIIa-H ADCP生物测定试剂盒 | Promega | -- |
| CHO-K1/Spike稳定细胞系 | GenScript | -- | |
| Bio-Glo试剂 | Promega | -- | |
| 酶标仪（BioTEK） | BioTEK | -- | |
| 动物实验 | K18-hACE2/hFcRn双转基因小鼠 | Jackson Labs | 037043 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体蛋白表达与纯化 | HEK-293F细胞密度、转染DNA量、PEI用量、表达时间、纯化方法 阅读提示：Materials and Methods: Expression and purification of Fab and IgG |
| 抗原表达与纯化 | HEK-293S细胞培养、转染DNA量、纯化步骤（HisTrap和SEC） 阅读提示：Materials and Methods: Design, expression, and purification of antigens for biolayer interferometry |
| 冷冻电镜结构解析 | 复合物制备比例、孵育时间、纯化方式、浓度、网格制备、数据收集参数（倾斜角度、电子剂量、像素大小）、数据处理流程 阅读提示：Materials and Methods: Cryo-EM structure determination of the OC43 S2-1871 Fab co-complex |
| mAb 1871与Fc受体的结合检测 | IgG浓度、Fc受体种类、固定化方法 阅读提示：Materials and Methods: Biolayer interferometry |
| ADCP分析 | 靶细胞和效应细胞数量、E:T比、孵育时间、检测试剂 阅读提示：Materials and Methods: Antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) |
| 小鼠攻毒保护实验 | 小鼠品系和年龄、体重、抗体给药途径和剂量、攻毒病毒株和剂量、观察时间和人道终点 阅读提示：Materials and Methods: Mice and SARS-CoV-2 challenges |
| 统计与生存分析 | 生存曲线比较方法（Mantel-Cox和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验） 阅读提示：Materials and Methods: Quantification and statistical analysis |