验证肥大细胞受体表达及病毒感染性
确认肥大细胞系上表达的病毒受体，并评估其支持冠状病毒感染的能力。
通过流式细胞术检测LAD2、LUVA和HMC-1细胞上ACE2、APN和DPP4的表达；用HCoV-229E和HCoV-NL63（MOI=1）感染细胞，通过RT-PCR检测核衣壳基因表达。
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冠状病毒刺突蛋白通过刺激Src/PI3K/AKT/Ca2+胞内信号级联激活肥大细胞脱颗粒
Spike proteins of coronaviruses activate mast cells for degranulation via stimulating Src/PI3K/AKT/Ca2+ intracellular signaling cascade.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（多种肥大细胞系）、病毒和重组蛋白刺激实验、转录组分析、信号通路抑制剂验证、钙离子和微管功能实验等，多层次验证机制，并涵盖功能验证。
主要模型
人类肥大细胞系LAD2 人类肥大细胞系LUVA 人类肥大细胞系HMC-1
重点核对
重组冠状病毒刺突蛋白/RBD蛋白，包括HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2，浓度5 μg/mL 人类冠状病毒HCoV-229E（ATCC VR-740）和HCoV-NL63（ATCC NR-470），MOI=1 PI3K抑制剂LY294002（100 μM）、Ca2+螯合剂BAPTA-AM（20 μM）、微管解聚剂Nocodazole（20 μM） MC脱颗粒检测通过β-己糖胺酶释放量化，阳性对照化合物48/80（C48/80） 蛋白质免疫印迹检测Src/p85-PI3K/AKT磷酸化，抗体如抗磷酸化Src (Tyr416)等
摘要
肥大细胞（MCs）位于宿主与环境之间的交界处。MCs在针对病原体的免疫监视中的非过敏功能最近受到重视。然而，病原体对MCs的激活可能有益或有害地调节免疫炎症，以抵抗或促进病原体入侵。我们和其他人已经确证，MCs在严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引发的高炎症反应中作为关键介质，导致小鼠和非人灵长类模型中多个器官的实质组织损伤。而病毒诱导的MC活化和脱颗粒的精确机制在很大程度上仍然难以捉摸，我们先前的研究结果表明，刺突蛋白与细胞受体的结合足以诱导MC活化并快速脱颗粒。本研究旨在证实冠状病毒诱导的MC脱颗粒的普遍性，并阐明刺突蛋白与细胞受体结合后介导MC活化的胞内信号通路。我们的转录组分析揭示了MCs在多种冠状病毒刺突蛋白/受体结合域（RBD）和病毒颗粒刺激下的活化。值得注意的是，这些刺突蛋白/RBD蛋白与细胞受体之间的相互作用触发了Src家族激酶（SFKs）成员Src激酶的活化。这种活化进而刺激PI3K/AKT信号通路，导致细胞内钙离子积累。这些钙离子随后促进微管依赖性颗粒转运，最终促进MC脱颗粒。总之，本研究阐明了病毒触发MCs活化的机制，并有可能有助于开发靶向MCs的抗病毒治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在证实不同冠状病毒诱导肥大细胞脱颗粒的普遍性，并阐明刺突蛋白与受体结合后介导肥大细胞活化的胞内信号通路。
- 核心机制
- 刺突蛋白/RBD与细胞受体（如ACE2、APN、DPP4）结合，激活Src激酶，进而刺激PI3K/AKT信号通路，导致细胞内钙离子积累，钙离子促进微管依赖性颗粒转运，最终引起肥大细胞脱颗粒。
- 主要证据
- 多种人类冠状病毒刺突蛋白/RBD刺激导致LAD2、LUVA和HMC-1细胞β-己糖胺酶释放增加；转录组分析显示炎症相关基因上调；LY294002抑制PI3K可阻断脱颗粒；BAPTA-AM螯合Ca2+或Nocodazole阻断微管重组均消除脱颗粒。
- 研究意义
- 本研究阐明了病毒触发肥大细胞活化的机制，为开发靶向肥大细胞的抗病毒治疗策略提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
刺突蛋白结合受体及诱导脱颗粒
验证不同冠状病毒的刺突蛋白/RBD与受体结合，并检测其对肥大细胞脱颗粒的诱导作用。
将重组刺突蛋白/RBD（5 μg/mL）与细胞在4°C孵育1小时，通过共聚焦显微镜检测共定位；用刺突蛋白/RBD或病毒处理细胞，通过β-己糖胺酶释放检测脱颗粒。
转录组分析及验证炎症因子表达
评估刺突蛋白/RBD和病毒颗粒对肥大细胞转录组的影响，并验证炎症反应相关基因的表达。
LAD2细胞经刺突蛋白/RBD（5 μg/mL）或病毒（MOI=1）处理24小时后，提取RNA进行RNA-seq；通过GO功能富集分析DEGs，并用RT-PCR验证IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的表达。
信号通路分析及抑制剂验证
阐明刺突蛋白诱导脱颗粒所依赖的胞内信号通路，并通过抑制剂验证其必要性。
用刺突蛋白/RBD处理LUVA细胞，通过免疫印迹检测Src、PI3K、AKT的磷酸化；在存在或不存在LY294002的情况下处理细胞，检测脱颗粒。
验证Ca2+和微管重组在脱颗粒中的作用
确定细胞内Ca2+升高和微管重组是否对刺突蛋白诱导的脱颗粒是必需的。
使用F03探针检测细胞内Ca2+变化；在存在BAPTA-AM或Nocodazole的情况下处理细胞，检测脱颗粒。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| StemPro-34培养基 | Gibco | -- | |
| 干细胞因子 | Novoprotein | -- | |
| 白细胞介素-6 | Novoprotein | -- | |
| 病毒和蛋白刺激 | HCoV-NL63刺突蛋白RBD | Sino Biological | 40600-V08H |
| SARS-CoV-2刺突蛋白RBD | Sino Biological | 40592-V08B | |
| HCoV-229E刺突蛋白RBD | Sino Biological | 40601-V08H | |
| HCoV-HKU1刺突蛋白RBD | Sino Biological | 40021-V08H | |
| HCoV-OC43刺突蛋白RBD | Sino Biological | 40607-V08H1 | |
| SARS-CoV刺突蛋白RBD | Sino Biological | 40150-V08B2 | |
| 人冠状病毒NL63 | ATCC | NR-470 | |
| 人冠状病毒229E | ATCC | VR-740 | |
| 脱颗粒检测 | 化合物48/80 | Sigma | C2313 |
| 抑制剂处理 | 诺考达唑 | MedChemExpress | HY-13520 |
| BAPTA-AM | MedChemExpress | HY-100545 | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| 免疫荧光 | 抗His抗体 | Abmart | M30111L |
| 抗ACE2抗体 | Proteintech | 21115-1-AP | |
| 抗APN抗体 | Invitrogen | PA5-109314 | |
| 抗DPP4抗体 | R&D | AF1180 | |
| F03细胞内钙离子荧光探针 | Biorab | HR0943 | |
| Western blot | 抗磷酸化PI3K/p85抗体 | Cell Signaling Technology | 4228S |
| 抗PI3K/p85抗体 | Cell Signaling Technology | 4257S | |
| 抗磷酸化AKT (T308)抗体 | Cell Signaling Technology | 13038S | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4619S | |
| 抗Src多克隆抗体 | Proteintech | 11097-1-AP | |
| 抗磷酸化Src家族(Tyr416)抗体 | Cell Signaling Technology | 6943 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abmart | M20006 | |
| RNA-seq | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| QIAseq FastSelect-rRNA HMR试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| NEBNext UltraTM RNA文库制备试剂盒 | NEB | -- | |
| RT-PCR | ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒 | TOYOBO | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源：LUVA和HMC-1购自Meisen CTCC；LAD2购自Huzhen Company。LAD2培养需补充干细胞因子和IL-6。 阅读提示：Materials and Methods, Cells, proteins, and viruses |
| 病毒和蛋白刺激 | 重组Spike/RBD蛋白浓度5 μg/mL；病毒MOI=1；处理时间用于脱颗粒检测为2小时，用于转录组为24小时。 阅读提示：Materials and Methods, Mast cell degranulation; Figure legends 1 and 2 |
| 脱颗粒检测 | 细胞数3×10^5；β-己糖胺酶释放检测方法；阳性对照C48/80浓度4 μg/mL。 阅读提示：Materials and Methods, Mast cell degranulation |
| 信号通路抑制 | LY294002浓度100 μM，BAPTA-AM 20 μM，Nocodazole 20 μM，处理时间2小时。 阅读提示：Materials and Methods, Mast cell degranulation; Figure legends 3 and 4 |
| Western blot | 抗体来源和稀释度未明确；细胞裂解和免疫印迹条件需参考方法部分。 阅读提示：Materials and Methods, Western blotting |