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        烯醇化酶1的非正构抑制阻碍三阴性乳腺癌的生长

        Non-orthosteric inhibition of enolase 1 impedes growth of triple-negative breast cancer.

        作者信息Dhanir Tailor, Fernando Jose Garcia-Marques, Abel Bermudez, Annah S Rolig, Benedikt Grau, Arpit Dheeraj, Dhanya K Nambiar, Wenqi Li, Kirsten Stefan, Shawn Campbell, Sharon J Pitteri, Sanjay V Malhotra
        PMID41205595
        期刊Cell Rep Med
        发布时间2025-11-18
        DOI10.1016/j.xcrm.2025.102451
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        研究涵盖体外细胞实验、多种体内小鼠模型（同系、转基因、PDX、糖尿病）以及机制和安全性验证，包括CETSA、BLI、SPR、蛋白质组学、PET等。

        主要模型

        三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、EMT6、PY8119等） 同系小鼠肿瘤模型（EMT6/Balb/c、PY8119/C57BL/6） MMTV-PyMT转基因小鼠乳腺癌模型 患者来源异种移植（PDX）模型（MA2821、CA1262、CA1616） 糖尿病小鼠模型（Db/Db）

        重点核对

        SU212与ENO1的物理结合通过CETSA、BLI和SPR验证 SU212诱导ENO1降解经由蛋白酶体和自噬途径，使用MG132和3MA抑制 SU212不直接抑制ENO1酶活性（酶活性测定） SU212在多个TNBC模型中抑制肿瘤生长和转移 SU212在糖尿病模型中降低血糖和改善脂肪肝

        摘要

        Tailor等人确定烯醇化酶1（ENO1）是SU212的靶点，SU212是三阴性乳腺癌（TNBC）的一种有前景的治疗候选药物。通过诱导ENO1降解，SU212在最小毒性下减少肿瘤生长，在糖尿病模型中保持疗效，并显示出良好的药理学特性，凸显了其临床转化的强大潜力。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        非正构抑制ENO1是否能够通过诱导其降解来抑制三阴性乳腺癌的生长和转移，并改善相关代谢紊乱？
        核心机制
        SU212结合ENO1并诱导其降解，导致细胞糖酵解和葡萄糖摄取降低，mTORC1信号下调，并影响ENO1的亚细胞定位，从而抑制肿瘤生长和转移。
        主要证据
        通过CETSA、BLI和SPR确认SU212与ENO1直接结合；SU212诱导ENO1降解并抑制细胞糖酵解；在多个TNBC动物模型（同系、PDX和MMTV-PyMT）中抑制肿瘤生长和转移；在Db/Db小鼠中抑制肿瘤生长并改善脂肪肝。
        研究意义
        SU212作为一种非正构ENO1抑制剂，具有双重作用潜力，既能破坏癌症代谢，又能改善代谢紊乱，为癌症治疗提供了一种变革性方法。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        靶点鉴定

        确定SU212的分子靶点

        使用CETSA结合质谱分析，鉴定SU212处理后热稳定性变化的蛋白质。

        2

        结合验证

        验证SU212与ENO1的直接物理相互作用

        使用BLI和SPR检测SU212与重组ENO1蛋白的结合。

        3

        体外功能验证

        评估SU212对TNBC细胞活力、克隆形成、迁移和糖酵解的影响

        进行细胞活力测定（CellTiter-Glo）、克隆形成实验、Matrigel侵袭实验和Seahorse糖酵解速率测定。

        4

        体内药效评估

        评估SU212在不同TNBC小鼠模型中的肿瘤生长抑制效果

        使用同系移植模型（EMT6和PY8119）、MMTV-PyMT转基因模型、PDX模型和Db/Db糖尿病模型，腹腔注射SU212或载体，测量肿瘤体积和重量。

        5

        转移评估

        评估SU212对TNBC转移的影响

        使用EMT6原位模型，治疗结束后收集肺组织进行H&E染色，计数转移灶。

        6

        机制验证

        阐明SU212诱导ENO1降解的机制及对细胞信号通路的影响

        使用蛋白酶体/自噬抑制剂（MG132、3MA、NH4Cl）处理细胞，检测ENO1表达；通过蛋白质组学和Western blot评估信号通路变化。

        7

        安全性和药代动力学评估

        评估SU212的毒性、药代动力学和安全性

        进行最大耐受剂量（MTD）测定、药代动力学（PK）研究、器官分布分析、代谢物鉴定、激酶谱分析及SafetyScreen44面板测试。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        细胞热位移分析生物层干涉法表面等离子体共振
        验证细胞功能变化
        细胞活力测定集落形成实验Matrigel侵袭实验
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹蛋白质组学免疫组织化学
        验证代谢变化
        Seahorse XF糖酵解速率测定FDG-PET/CT
        评估体内效果
        肿瘤异种移植模型Kaplan-Meier生存分析
        数据分析与统计
        基因集富集分析液相色谱-串联质谱

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        SU212合成SU212Malhotra Lab--
        靶点鉴定TMT10plex等压标记试剂盒Thermo Scientific90110
        结合验证ENO1蛋白Sino Biological11554-H07E-100
        ENO3蛋白Sino Biological14270-H07E
        Western blotENO1抗体Abcamab227978
        β-肌动蛋白抗体Cell Signaling Technology4970S
        GAPDH抗体Cell Signaling Technology2118S
        β-连环蛋白抗体Cell Signaling Technology8480T
        核纤层蛋白B1抗体Cell Signaling Technology13435S
        COX4抗体Cell Signaling Technology38563
        ENO3抗体Novus BiologicalsNBP1-31764
        抗小鼠IgG HRP标记抗体Cell Signaling Technology7076
        抗兔IgG HRP标记抗体Cell Signaling Technology7074
        细胞培养RPMI-1640培养基Corning10-040-CV
        胎牛血清Corning35-015-CV
        抗生素-抗真菌溶液Corning15240062
        细胞处理依托泊苷Sigma-Aldrich--
        MG132Selleck ChemicalsS2619
        3-甲基腺嘌呤Cayman Chemical Company13242
        氯化铵Fisher ScientificAC199975000
        细胞培养基质胶Corning356237
        Western blotM-PER裂解液Thermo Scientific78503
        Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物Thermo Scientific78440
        蛋白检测ENO1抑制剂筛选试剂盒Abcamab283399
        细胞凋亡检测RealTime-Glo Annexin V凋亡和坏死检测PromegaJA1011
        代谢检测Seahorse XF糖酵解速率测定试剂盒Agilent Technologies103344-100
        细胞组分分离NE-PER核胞质提取试剂盒Thermo Scientific78833
        Mem-PER Plus膜蛋白提取试剂盒Thermo Scientific89842
        线粒体/胞质分离试剂盒MilliporeSigmaMIT1000
        基因表达分析nCounter小鼠代谢通路面板NanoString Technologies115000374
        细胞活力CellTiter-Glo试剂PromegaG7572
        动物实验True Metrix血糖仪TRUE METRIXB08DXNC949
        免疫组化柑橘透明溶剂Thermo Scientific8301
        正常马血清Vector Laboratories30021
        抗兔二抗Vector Laboratories30025
        澄清剂1Thermo Scientific7401
        Paramount封片剂Fisher ChemicalSP15
        Western blotImmobilon Crescendo Western HRP底物MilliporeWBLUR0500

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        靶点鉴定
        CETSA实验：细胞系MDA-MB-231，SU212浓度0.5 μM，处理1.5小时，温度范围37-67°C（具体温度点：37,41,44,47,50,53,56,59,63,67°C），细胞密度1x10^6/100μL。
        阅读提示：STAR Methods: CETSA analysis
        结合验证
        BLI：His标记ENO1/ENO3蛋白浓度50 μg/mL，SU212浓度10,5,1 μM；SPR：生物素化SU212，ENO1浓度0.125-4 μM，流速30 μL/min，结合时间120s，再生600s。
        阅读提示：STAR Methods: BLI analysis; SPR analysis
        体外功能验证
        细胞活力测定：细胞密度2000-4000/孔，SU212处理48小时；克隆形成：细胞密度200-2000/孔，处理6-10天；侵袭实验：细胞数50,000，Matrigel 1:1混合，处理5-7天。
        阅读提示：STAR Methods: Cell viability assay; Colony formation assay; Cell invasion assay
        体内药效评估
        同系、转基因和PDX模型：剂量20或30 mg/kg，腹腔注射，每周5天，21-24天；Db/Db模型：剂量10 mg/kg，每周5天，32天。
        阅读提示：STAR Methods: In vivo studies; Orthotopic xenograft studies; FVB/N-Tg(MMTV-PyVT)634Mul/J mice model
        转移评估
        EMT6原位模型：细胞数1x10^5，NSG小鼠，SU212 30 mg/kg，每周5天，21天，肺部转移灶计数。
        阅读提示：STAR Methods: In vivo studies; Orthotopic xenograft studies
        机制验证
        SU212 0.5 μM，6小时，MG132、3MA、NH4Cl浓度未具体说明（文中未明确说明）。
        阅读提示：STAR Methods: Immunoblotting
        安全性和药代动力学评估
        MTD：剂量100,200,400 mg/kg，单次腹腔注射，观察72小时；PK：剂量50 mg/kg，取血时间点未具体列出（见图7）；器官分布：时间点2,4,24小时。
        阅读提示：STAR Methods: MTD assay; Drug pharmacokinetic and organ distribution study

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