构建人肾类器官SI-AKI模型
建立模拟人类SI-AKI的体外模型，验证类器官成功分化及LPS处理效果。
利用hPSC H1细胞逐步分化生成HKO，并通过qPCR、IF、HE染色鉴定肾上皮和足细胞标记物；用不同浓度LPS处理HKO，选择50 μg/mL进行后续实验，检测ATP、大小、Fe2+及炎症因子。
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USP18通过稳定STING1促进脂多糖诱导的人肾类器官中的铁死亡
USP18 promotes ferroptosis in lipopolysaccharide-induced human kidney organoids by stabilizing STING1.
实验完整度
中包含体外细胞和类器官模型，以及功能验证、机制验证；但缺乏体内实验支撑。
主要模型
人肾类器官（HKO） HEK293T细胞 THP-1细胞
重点核对
LPS剂量：50 μg/mL USP18敲低：shUSP18-1，MOI=50 STING1过表达：Flag-STING1 Fer-1浓度：0.25 μM，处理24小时
摘要
脓毒症相关急性肾损伤（SI-AKI）是一种预后不良且治疗选择有限的严重疾病。铁死亡加剧了SI-AKI造成的损伤，但调控铁死亡的机制，尤其是涉及泛素化调节因子的机制，仍然知之甚少。在此，我们使用脂多糖（LPS）诱导的人肾类器官（HKO）模型来研究SI-AKI中的铁死亡。对对照组和LPS处理的HKO进行RNA测序（RNA-seq）分析，发现USP18是响应LPS唯一上调的泛素特异性蛋白酶（USP）。进一步研究表明，USP18的缺失显著减少了LPS诱导的HKO中的铁死亡。为了探索USP18促铁死亡作用的机制，我们筛选了四种铁死亡相关驱动因子，并确定STING1是与USP18相互作用的关键蛋白。在机制上，USP18直接结合STING1，对其去泛素化，并阻止其蛋白酶体降解。在USP18缺陷的HKO中过表达STING1会加剧铁死亡，表明STING1对于介导USP18在LPS诱导的HKO中的促铁死亡功能至关重要。总之，这些发现确立了USP18-STING1轴在LPS诱导的HKO铁死亡中的作用，表明靶向USP18-STING1可能为治疗SI-AKI提供新的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- USP18是否通过调控铁死亡参与脓毒症相关急性肾损伤（SI-AKI）的发病机制，其具体分子机制是什么？
- 核心机制
- USP18直接结合STING1，通过去泛素化阻止STING1的蛋白酶体降解，从而稳定STING1，进而促进LPS诱导的HKO铁死亡。
- 主要证据
- 在LPS诱导的HKO中，USP18敲低抑制铁死亡（降低MDA、ROS、Fe2+，增加GSH），而过表达STING1逆转该效应；Co-IP和GST pull-down证实USP18与STING1直接结合，IP实验显示USP18降低STING1泛素化水平并延长其半衰期。
- 研究意义
- 揭示USP18-STING1轴在SI-AKI铁死亡中的新机制，为SI-AKI治疗提供潜在新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RNA-seq筛选关键USP
鉴定LPS诱导HKO中表达变化的USP，寻找潜在的关键去泛素化酶。
对对照和LPS处理组HKO进行RNA-seq，分析DEGs，并与已知75个USP取交集，结合qPCR验证。
验证USP18对铁死亡的功能
评估USP18敲低对LPS诱导HKO铁死亡的影响。
通过慢病毒shRNA敲低USP18，检测细胞活力、类器官大小、铁死亡指标（MDA、GSH、GSSG、ROS、Fe2+）和铁死亡相关蛋白表达。
验证USP18与STING1的相互作用及去泛素化
阐明USP18如何调控STING1的稳定性。
通过Co-IP筛选互作蛋白，GST pull-down验证直接结合，IP检测泛素化水平，CHX追踪实验检测蛋白降解速率。
验证STING1介导USP18促铁死亡功能
证实STING1是USP18促铁死亡功能的关键下游介质。
在USP18敲低HKO中过表达STING1，观察铁死亡表型变化。
USP18过表达及Fer-1救援实验
进一步确认USP18在铁死亡中的作用，并验证铁死亡抑制剂Fer-1的效应。
在LPS处理的HKO中过表达USP18，同时给予Fer-1，检测铁死亡指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 类器官生成 | mTeSR™1培养基 | STEMCELL | 85850 |
| Y-27632 | MedChemExpress | -- | |
| APEL2培养基 | STEMCELL | 05270 | |
| CHIR99021 | MedChemExpress | HY-10182 | |
| 成纤维细胞生长因子9 | Sinobiological | 10,262-HNAE | |
| 肝素 | Yeasen | 60351ES03 | |
| 细胞培养 | TrypLE™ Express | Gibco | 12,605-010 |
| LPS处理 | 脂多糖 | -- | -- |
| 铁死亡救援 | Ferrostatin-1 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 抗人CK19抗体 | Proteintech | 10,712–1-AP |
| 抗人PODXL抗体 | Immunoway | RLM0526 | |
| 荧光二抗 | Immunoway | RS0011 | |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0027 |
| qPCR | TRIzol | -- | -- |
| RaPure总RNA提取试剂盒 | Magen Biotech | R4011-02 | |
| All-in-One第一链cDNA合成预混液 | NYBio | EG15133S | |
| ChamQ SYBR Color qPCR预混液 | Vazyme | Q431-02 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL化学发光底物 | Beyotime | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 抗USP18抗体 | Proteintech | 12,153–1-AP | |
| 抗ACSL4抗体 | Ruiying Bio | RLT8070 | |
| 抗COX2抗体 | Proteintech | 12,375–1-AP | |
| 抗FTH1抗体 | Ruiying Bio | RLT1692 | |
| 抗GPX4抗体 | Proteintech | 67,763–1-AP | |
| 抗STING1抗体 | Abcam | ab188157 | |
| 抗iNOS抗体 | Abcam | ab3523 | |
| 抗Arg-1抗体 | Proteintech | 16,001–1-AP | |
| 抗Actin抗体 | Proteintech | 23,660–1-AP | |
| 抗Flag标签抗体 | Proteintech | 20,543–1-AP | |
| 抗HA标签抗体 | Proteintech | 51,064–2-AP | |
| 抗His标签抗体 | Proteintech | 10,001–0-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| MDA/GSH/GSSG/Fe2+检测 | MDA检测试剂盒 | Solarbio | BC0020 |
| Fe2+检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K881-M | |
| ROS检测 | DCF-DA试剂盒 | Yeasen | 50101ES01 |
| NovoCyte 1300流式细胞仪 | Agilent | -- | |
| Co-IP | 抗FLAG磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| 抗HA BeyoMag™蛋白A+G磁珠 | Beyotime | P2121-2 ml | |
| GST pull-down | 谷胱甘肽琼脂糖4B磁珠 | GE | 17-0756-01 |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | -- | -- |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0109 |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0149 | |
| RNA-seq | TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism | -- | v8 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官生成 | hPSC H1细胞培养至70%融合度，TrypLE™ Express消化5分钟，mTeSR™1培养基重悬，Y-27632浓度10 μM，细胞密度5×10^4 cells/mL，超低吸附6孔板培养过夜。后续分化：APEL2+CHIR99021 (8 μM) D0-D3，APEL2+FGF9 (200 ng/mL)+heparin (1 μg/mL) D4-D6，D7 CHIR99021 (5 μM) 1小时，D7-D10 APEL2+FGF9+heparin，D26收获。 阅读提示：Materials and methods：Generation of HKOs |
| LPS处理 | LPS浓度50 μg/mL，处理时间24小时。 阅读提示：Materials and methods：Treatment of HKOs；Results：Establishment of HKO modeling SI-AKI |
| USP18敲低 | shUSP18-1序列，慢病毒感染MOI=50，感染时间24小时。 阅读提示：Materials and methods：Plasmid construction；Results：USP18 knockdown mitigates ferroptosis in LPS-treated HKOs |
| 铁死亡检测指标 | 检测ATP、类器官直径、MDA、GSH、GSSG、ROS、Fe2+，具体试剂盒品牌及操作步骤见原文。 阅读提示：Materials and methods：ATP concentration measurement；MDA, GSH, GSSG, and Fe2+ Levels measurement；ROS detection |
| Western blot | 抗体信息（Table 3），包括种属、品牌、货号、稀释比。 阅读提示：Materials and methods：Western blot；Table 3 |
| Co-IP | 使用anti-FLAG beads或anti-HA磁珠，室温孵育2小时，洗脱条件详见原文。 阅读提示：Materials and methods：Co-immunoprecipitation (Co-IP) |
| GST pull-down | His-STING1与GST-USP18各20 mg，4℃孵育6小时，洗脱95℃ 10分钟。 阅读提示：Materials and methods：GST pull-down assay |
| 泛素化检测 | IP实验检测泛素化水平，具体步骤略，需参考原文。 阅读提示：Materials and methods：Co-immunoprecipitation; Results：USP18 controls proteasomal degradation of STING1 in HKOs |