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          多种癌症类型骨转移生态系统的单细胞分析揭示骨定植的趋同与趋异机制

        多种癌症类型骨转移生态系统的单细胞分析揭示骨定植的趋同与趋异机制

        Single-cell profiling of bone metastasis ecosystems from multiple cancer types reveals convergent and divergent mechanisms of bone colonization.

        作者信息Fengshuo Liu, Yunfeng Ding, Zhan Xu, Xiaoxin Hao, Tianhong Pan, George Miles, Siyue Wang, Yi-Hsuan Wu, Jun Liu, Igor L Bado, Weijie Zhang, Ling Wu, Yang Gao, Liqun Yu, David G Edwards, Hilda L Chan, Sergio Aguirre, Michael Warren Dieffenbach, Elina Chen, Yichao Shen, Dane Hoffman, Luis Becerra Dominguez, Charlotte Helena Rivas, Xiang Chen, Hai Wang, Zbigniew Gugala, Robert L Satcher, Xiang H-F Zhang
        PMID40412393
        期刊Cell Genom
        发布时间2025-07-09
        DOI10.1016/j.xgen.2025.100888
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        该研究包含scRNA-seq数据分析、免疫荧光验证、bulk转录组验证、体外破骨细胞生成实验等多个独立证据层级，并进行了功能验证。

        主要模型

        人骨转移组织样本 CD14+单核细胞来源的破骨细胞分化模型

        重点核对

        骨转移样本来自42例患者，涵盖8种癌症类型 体外破骨细胞生成使用CD14+单核细胞，以M-CSF和RANKL诱导 信号因子处理浓度范围：TWEAK、COMP、NRG1等均设置梯度浓度 qPCR检测破骨细胞标志基因TRAP、CTSK、DC-STAMP、NFATC1 免疫荧光染色验证关键细胞类型，使用CTSK、CD4+FOXP3、CD8+TIM3标记

        摘要

        Liu等人分析了来自八种癌症类型的人骨转移单细胞RNA测序数据，识别出三种免疫生态系统原型。这些原型展示了独特而趋同的免疫抑制和骨重塑机制，揭示了之前未被认识的转移异质性，并为骨转移提出了靶向治疗策略。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        不同癌症类型的骨转移是否具有不同的生态系统构成，以及这些差异如何影响骨定植和免疫逃逸机制
        核心机制
        骨转移根据微环境细胞组成分为三种免疫原型，分别以巨噬细胞/破骨细胞、单核细胞、调节性/耗竭T细胞富集为特征，不同原型通过不同的免疫抑制和骨重塑机制促进骨定植
        主要证据
        对42例骨转移样本的scRNA-seq分析识别出三种原型，并通过免疫荧光染色和158例骨转移的bulk转录组数据验证；体外实验证实TWEAK、COMP、NRG1促进破骨细胞生成，而SEMA4A、EFNA5、TNFSF10、BMP8A抑制该过程
        研究意义
        揭示了骨转移的异质性，提示针对不同免疫原型可能采用不同的治疗策略，特别是对破骨细胞靶向治疗不敏感的肾癌骨转移

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        单细胞RNA测序及数据预处理

        获取骨转移样本的全面细胞组成图谱

        使用cell hashing策略对42例骨转移和5例健康供者骨髓样本进行单细胞转录组测序，通过SVM分类和人工验证注释32种细胞类型，并进行批次校正

        2

        免疫原型识别

        鉴定不同骨转移样本的免疫细胞组成模式

        基于免疫细胞频率进行无监督层次聚类，识别出三种免疫原型：单核细胞富集型、巨噬细胞/破骨细胞富集型和调节性/耗竭T细胞富集型

        3

        免疫原型验证

        独立验证三种免疫原型的细胞组成差异

        通过免疫荧光染色检测组织切片中破骨细胞（CTSK）、Treg（CD4+FOXP3）和Tex（CD8+TIM3）细胞的比例，比较不同原型间的差异

        4

        bulk转录组数据验证

        在更大规模数据集中验证免疫原型的普遍性

        收集158例来自6个数据集的骨转移组织，使用ssGSEA估计细胞频率，并进行无监督聚类验证原型

        5

        轨迹推断分析

        探索不同原型中髓系细胞和T淋巴细胞的分化轨迹差异

        使用Dynamo包进行RNA velocity分析，推断单核细胞向巨噬细胞/破骨细胞、初始CD4 T细胞向Treg、CD8 Teff向Tex的分化轨迹

        6

        拷贝数变异分析

        评估肿瘤细胞的基因组不稳定性及其与免疫原型的关系

        使用infercnv推断上皮细胞的拷贝数变异，将肿瘤细胞分为高CNV和低CNV组，并分析其在不同原型和癌症类型中的分布

        7

        细胞间通讯分析

        揭示不同原型中细胞间信号相互作用的差异

        使用CellChat算法比较Mφ-OC和Treg-Tex原型的信号发送和接收模式，识别差异信号通路

        8

        体外破骨细胞生成实验

        验证预测的信号分子对破骨细胞生成的调控作用

        从健康供体外周血分离CD14+单核细胞，在RANKL和M-CSF存在下诱导破骨细胞生成，并加入预测的信号因子，通过qPCR和TRAP染色评估效果

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        单细胞转录组分析
        单细胞RNA测序细胞哈希标签
        验证样本或模型特征
        免疫荧光染色苏木精-伊红染色拷贝数变异推断
        验证机制链路
        RNA速率分析CellChat细胞通讯分析
        数据分析与统计
        支持向量机单样本基因集富集分析基因集变异分析主成分分析基因集富集分析
        体外破骨细胞生成实验
        抗酒石酸酸性磷酸酶染色定量PCR

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        体外破骨细胞生成重组人巨噬细胞集落刺激因子PeprotechAF-300-25
        重组人可溶性RANKLPeprotechAF-310-01
        重组人TWEAKSino Biological90094-C04H
        重组人COMPSino Biological10173-H08H
        重组人NRG1Sino Biological10658-H08H
        重组人SEMA4ASino Biological11756-H08H-100
        重组人EFNA5Sino Biological10192-H08H-100
        重组人TNFSF10Sino Biological10409-HNAE-100
        重组人BMP8AMedChemExpressHY-P700031AF
        免疫荧光染色小鼠抗人CD4抗体ThermoFisher scientific14-2444-82
        小鼠抗人CD8a抗体ThermoFisher scientific14-0008-82
        兔抗人TIM-3抗体Cell Signaling Technology45208
        兔抗人FoxP3抗体Cell Signaling Technology98377
        兔抗人组织蛋白酶K抗体Abcamab19027
        Dako抗原修复液pH 9.0Agilent TechnologiesS2367
        Dako柠檬酸抗原修复液pH 6.1Agilent TechnologiesS1699
        Vector TrueVIEW自发荧光淬灭试剂盒Vector LaboratoriesSP-8500-15
        Hoechst 33342染料Thermo Fisher Scientific62249
        ProLong Gold抗淬灭封片剂InvitrogenP36934
        驴抗小鼠Alexa Fluor 488二抗Jackson ImmunoResearch715-545-151
        驴抗兔Alexa Fluor 555二抗InvitrogenA-31572
        驴抗大鼠Alexa Fluor 647二抗Jackson ImmunoResearch712-605-153
        驴抗大鼠Alexa Fluor 488二抗Jackson ImmunoResearch712-545-153
        体外破骨细胞生成白细胞酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒Sigma-Aldrich387A
        mRNA提取Direct-zol RNA小提试剂盒Zymo ResearchR2052
        cDNA合成RevertAid第一链cDNA合成试剂盒Thermo Fisher ScientificK1622
        qPCRPowerUp SYBR Green预混液Thermo Fisher ScientificA25741
        CFX96实时荧光定量PCR仪Biorad--
        单细胞解离II型胶原酶Gibco17101-015
        中性蛋白酶IIRoche13437500
        红细胞裂解液Tonbo BiosciencesTNB-4300-L100
        CD14+单核细胞分离人CD14+磁珠Miltenyi Biotec130-050-201
        LS分选柱Miltenyi Biotec130-042-401
        成像LSM 780共聚焦显微镜Zeiss--
        Axioscan.Z1扫描仪Zeiss--
        体外破骨细胞生成成像BioTek Cytation 5Agilent Technologies--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        单细胞RNA测序
        样本处理流程：组织大小、冻存缓冲液成分、解离条件（胶原酶和dispase浓度、时间）、细胞筛选标准（DAPI和Ghost dye阴性）、测序深度
        阅读提示：STAR Methods中'Single-cell RNA library preparation and sequencing of freeze-thawed tissue samples'部分
        免疫荧光染色
        抗体浓度和抗原修复条件
        阅读提示：STAR Methods中'Tissue preparation and immunofluorescence staining'部分及Key resources table
        体外破骨细胞生成
        CD14+单核细胞分离方法、M-CSF和RANKL浓度、信号因子浓度、培养时长、qPCR检测基因
        阅读提示：STAR Methods中'Isolation of CD14+ monocytes from peripheral blood for osteoclastogenesis'和'mRNA extraction and qRT-PCR'部分
        批量转录组数据分析
        数据来源、批次校正方法、ssGSEA标志基因选择
        阅读提示：STAR Methods中'Estimation of cell type frequencies from bulk/microarray data'部分

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