验证IFNγ与TNF协同诱导细胞死亡及iNOS作用
确认TNF/IFNγ在多种细胞中诱导死亡，并评估iNOS在其中的作用。
处理多种人鼠癌细胞系和BMDM，检测细胞死亡、iNOS表达、NO产生。
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TNF和IFNγ诱导的细胞死亡需要IRF1和ELAVL1促进CASP8表达
TNF and IFNγ-induced cell death requires IRF1 and ELAVL1 to promote CASP8 expression.
实验完整度
高包含体外细胞实验、CRISPR-Cas9筛选和基因敲除/敲入、体内患者样本分析等多层级验证。
主要模型
HeLa人宫颈癌细胞系 HCT-116人结直肠癌细胞系 小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM) 黑色素瘤患者肿瘤样本队列
重点核对
TNF/IFNγ处理浓度和时间：HeLa、U2OS等细胞用50 ng/ml TNF+100 ng/ml IFNγ；HCT-116用2 ng/ml TNF+100 ng/ml IFNγ；HT-29用50 ng/ml TNF+12.5 ng/ml IFNγ。 CASP8和CYLD启动子ISRE位点突变(KI)对IFNγ诱导表达的影响。 ELAVL1 KO对CASP8 mRNA稳定性和细胞死亡的影响。 JAK抑制剂(PF-04965842、Upadacitinib)处理浓度(3 μM)。
摘要
邓等人证明，TNF/IFNγ诱导的癌细胞死亡是通过IRF1直接结合CYLD和CASP8启动子，增强它们的表达而发生的。此外，他们发现ELAVL1结合CASP8 mRNA，稳定它并促进TNF启动的死亡。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IFNγ如何通过IRF1及其下游靶基因促进TNF诱导的caspase-8激活和癌细胞死亡？
- 核心机制
- IFNγ通过JAK1/JAK2/STAT1/IRF1通路转录上调CYLD和CASP8，同时ELAVL1结合CASP8 mRNA增强其稳定性和翻译效率，共同促进TNF/IFNγ诱导的caspase-8依赖的细胞死亡。
- 主要证据
- 通过RNA-seq和CRISPR-Cas9筛选鉴定出CYLD和CASP8；在多种癌细胞系中验证IFNγ诱导CYLD和CASP8表达；敲除或敲降CYLD/CASP8阻断细胞死亡；ELAVL1 KO降低CASP8 mRNA稳定性并抑制细胞死亡。
- 研究意义
- 研究结果为肿瘤免疫治疗和炎症性疾病提供了有价值的线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组和CRISPR筛选鉴定IFNγ下游靶基因
寻找IRF1下游介导TNF/IFNγ诱导细胞死亡的基因。
对IFNγ处理的HeLa细胞进行RNA-seq，并进行全基因组CRISPR-Cas9筛选。
验证IFNγ诱导CYLD和CASP8表达
确认IFNγ上调CYLD和CASP8在多种细胞中的表达。
qPCR和免疫印迹检测IFNγ处理后CYLD、CASP8的mRNA和蛋白水平。
遗传学验证CYLD和caspase-8在TNF/IFNγ诱导死亡中的作用
确定CYLD和caspase-8是否必需。
使用CRISPR-Cas9敲除或shRNA敲低CYLD、CASP8，并过表达测试。
编辑CASP8和CYLD启动子ISRE位点验证IRF1结合
证明IRF1通过ISRE直接调控CASP8和CYLD转录。
通过同源重组引入ISRE突变，检测IFNγ诱导表达和细胞死亡。
验证JAK1/JAK2/STAT1/IRF1通路必要性
确认该通路对于IFNγ诱导CYLD/CASP8表达及死亡的作用。
敲除通路成员或使用JAK抑制剂处理，检测蛋白表达和细胞死亡。
ELAVL1功能验证
确定ELAVL1在TNF/IFNγ诱导死亡中的作用及机制。
敲除ELAVL1，检测CASP8 mRNA稳定性、蛋白表达、多聚核糖体分布、多种死亡刺激下的细胞死亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | C11875500BT | |
| McCoy's 5A培养基 | Gibco | 16600082 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 药物处理 | 肿瘤坏死因子 | Sino Biological | 10602-HNAE |
| 干扰素γ | Sino Biological | 11725-HNAS | |
| 白细胞介素-1β | Sino Biological | 10139-HNAE | |
| Smac模拟物 | NIBS | CAS No.: 411230-24-5 | |
| ABT-737 | Sigma-Aldrich | 197333 | |
| S63845 | MedChemExpress | HY-100741 | |
| L-NAME | MedChemExpress | HY-18729A | |
| 1400W | MedChemExpress | HY-18731 | |
| 乌帕替尼 | MedChemExpress | HY-19569 | |
| PF-04965842 | MedChemExpress | HY-107429 | |
| 细胞活力测定 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7573 |
| 细胞死亡测定 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | 537059 |
| CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G1780 | |
| Western blotting | cOmplete EDTA-free蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 05892791001 |
| 硝酸纤维素膜 | PALL | 66485 | |
| 化学发光底物 | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| 抗iNOS兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 13120 | |
| 抗HSP90兔单克隆抗体 | Proteintech | 13171-1-AP | |
| 抗caspase-8兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4790 | |
| 抗剪切caspase-8兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9496 | |
| 抗caspase-3兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| 抗caspase-7兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9492 | |
| 抗GSDME兔单克隆抗体 | Abcam | ab215191 | |
| 抗β-actin兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗GAPDH兔单克隆抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| 抗RIP1兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3493 | |
| 抗CYLD兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 8462 | |
| 抗FADD兔单克隆抗体 | Proteintech | 14906-1-AP | |
| 抗IRF1兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 8478 | |
| 抗JAK1兔单克隆抗体 | Abcam | ab138005 | |
| 抗JAK2兔单克隆抗体 | Abcam | ab108596 | |
| 抗磷酸化JAK1兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3331 | |
| 抗STAT1兔单克隆抗体 | Abcam | ab23400 | |
| 抗TNFR1兔单克隆抗体 | Proteintech | 21574-1-AP | |
| 抗TRADD小鼠单克隆抗体 | Abcam | ab280374 | |
| 抗TRAF2兔单克隆抗体 | Abcam | ab126758 | |
| 抗cIAP1兔单克隆抗体 | Abcam | ab108361 | |
| 抗XIAP兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2045 | |
| 抗cFLIP兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 56343 | |
| 抗Tubulin兔单克隆抗体 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| 抗A20兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 5630 | |
| 抗OTULIN兔单克隆抗体 | Abcam | ab211328 | |
| 抗SPATA2小鼠单克隆抗体 | Santa Cruz | sc-515283 | |
| 抗TAK1兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 5206 | |
| 抗TBK1兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3504 | |
| 抗caspase-9小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9508 | |
| 抗IFNGR1兔单克隆抗体 | Abcam | ab134070 | |
| 抗磷酸化STAT1兔单克隆抗体 | Abcam | ab109457 | |
| 抗ELAVL1兔多克隆抗体 | Proteintech | 11910-1-AP | |
| 抗HA标签单克隆抗体-HRP | Medical and Biological Laboratories | M180-7 | |
| 抗兔HRP二抗 | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| 抗小鼠HRP二抗 | Sigma-Aldrich | A9044 | |
| 基因沉默 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | TOYOBO | -- |
| Takara SYBR Premix Ex Taq试剂盒 | Takara | RR420A | |
| CRISPR筛选 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| CRISPR敲入 | NU7026 | Sigma-Aldrich | N1537 |
| NO测量 | Griess试剂盒 | Invitrogen | G7921 |
| ChIP | ChIP级蛋白A+G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 26162 |
| 双荧光素酶报告基因 | pGL6 basic载体 | Beyotime | D2102 |
| pRL-TK海肾荧光素酶质粒 | Beyotime | D2760 | |
| 荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | E1980 | |
| RNA IP | RNase抑制剂 | Invitrogen | 10777019 |
| 抗Flag M2琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | A2220 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 各细胞系所用培养基、FBS浓度、细胞密度、TNF和IFNγ浓度及处理时间。 阅读提示：Materials and methods: Cell culture; Treatment of cancer cells with cytokines and compounds |
| 细胞死亡测定 | 细胞种子密度、处理时间、PI浓度、LDH检测方法。 阅读提示：Materials and methods: Cell death assay by propidium iodide staining; Cell death assay by LDH release |
| 基因编辑 | CASP8和CYLD启动子ISRE突变序列、sgRNA序列、转染条件。 阅读提示：Materials and methods: Knockin mutation of ISRE motifs in the CASP8/CYLD promoter region |
| ELAVL1功能验证 | ELAVL1 KO克隆、回补WT或突变体、RNA IP条件、多聚核糖体分析条件。 阅读提示：Materials and methods: RNA IP; Polysome fractionation; Results: ELAVL1 is required for death receptors–initiated cell death by stabilizing caspase-8 |