体外抗肿瘤活性筛选
筛选出抑制骨肉瘤细胞活力的天然化合物。
测试200多种天然化合物对143B细胞活力的影响，发现BEA显著降低细胞活力，选为研究药物。
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白僵菌素通过选择性抑制TGFBR2通路抑制骨肉瘤的增殖和肺转移
Beauvericin suppresses the proliferation and pulmonary metastasis of osteosarcoma by selectively inhibiting TGFBR2 pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（增殖、迁移、侵袭）、分子机制研究（DARTS、CETSA、MST、激酶活性）、体内动物模型（原位异种移植）及患者样本分析，多层级验证。
主要模型
人骨肉瘤细胞系143B、U2OS、SJSA-1 人永生化成骨细胞hFOB 1.19 BALB/c裸鼠原位异种移植模型 骨肉瘤患者血清样本（文献提及）
重点核对
BEA处理浓度：1-10 μM（体外） TGF-β1刺激浓度（未明确，需查原文） BEA给药剂量：2.5和5 mg/kg（静脉注射，每天一次） 处理时间：24小时（体外），14天（体内）
摘要
骨肉瘤（OS）患者，尤其是伴有远处转移者，病情进展迅速，且从传统治疗中获得的生存获益不佳。目前，治疗转移性OS患者的有效药物仍然匮乏。本研究发现，环状六缩肽白僵菌素（BEA）作为一种新型选择性TGFBR2抑制剂，对OS细胞具有强效的抗增殖和抗转移活性。功能上，BEA抑制TGF-β信号介导的OS细胞增殖、侵袭性、间充质表型和细胞外基质重塑，并在体内抑制肿瘤生长和减少肺转移。机制研究表明，BEA选择性地直接结合TGFBR2的Asn 332并抑制其激酶活性，从而抑制OS细胞的侵袭性进展。总之，我们的研究鉴定了一种创新的天然选择性TGFBR2抑制剂，对转移性OS具有有效的抗肿瘤活性，并表明靶向TGFBR2可能是转移性OS的潜在治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 白僵菌素能否抑制骨肉瘤的增殖和肺转移，其分子机制是什么？
- 核心机制
- BEA直接结合TGFBR2的Asn332位点，抑制TGFBR2激酶活性，从而阻断TGF-β/Smad2/3信号通路，抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、间充质表型和ECM重塑。
- 主要证据
- 体外实验显示BEA抑制细胞活力、克隆形成、迁移和侵袭；通过DARTS、CETSA、MST等证明BEA与TGFBR2直接结合；体内实验显示BEA抑制肿瘤生长和肺转移，并降低p-Smad2/3水平。
- 研究意义
- 作者提出BEA可作为转移性骨肉瘤的潜在治疗药物，并建议进一步研究其在纤维化疾病等TGF-β相关疾病中的疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能验证
验证BEA对骨肉瘤细胞增殖和运动能力的抑制作用。
使用MTT、克隆形成、划痕愈合、Transwell迁移和侵袭实验评估BEA对143B、U2OS和SJSA-1细胞的影响。
信号通路分析
探索BEA抑制骨肉瘤细胞恶性行为的分子机制。
进行磷酸化蛋白质组学分析，KEGG富集发现TGF-β通路，随后验证BEA对TGF-β/Smad2/3通路的影响。
靶点验证
验证BEA是否直接结合TGFBR2并抑制其激酶活性。
通过DARTS、CETSA、MST和分子对接预测BEA与TGFBR2的结合，并通过激酶活性测定验证抑制效果。
突变分析
确定BEA与TGFBR2结合的关键氨基酸残基。
构建TGFBR2突变体（N332D、N332T、K252R），通过DARTS和Western blot验证BEA对突变体的结合和功能影响。
体内药效评估
验证BEA在体内对骨肉瘤增殖和肺转移的抑制作用。
建立143B原位异种移植小鼠模型，BEA静脉注射治疗，评估肿瘤生长、肺转移灶及毒性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 白僵菌素 | -- | -- |
| 对照组处理 | SB431542 | TargetMol | T1726 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | FSP500 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| G-418硫酸盐 | TargetMol | T6512 | |
| Western blotting | Smad2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 8685 |
| 磷酸化Smad2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 8828 | |
| N-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 13115 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 14472 | |
| 波形蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| Slug抗体 | Cell Signaling Technology | 9585 | |
| ZEB1抗体 | Cell Signaling Technology | 70512 | |
| FAK抗体 | Cell Signaling Technology | 71433 | |
| 磷酸化FAK抗体 | Cell Signaling Technology | 8556 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | #4970 | |
| Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 14220 | |
| 活化的Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| His标签抗体 | Cell Signaling Technology | 12698 | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 5017 | |
| TGFBR2抗体 | Affinity Biosciences | AF5449 | |
| 磷酸化TGFBR2抗体 | Affinity Biosciences | AF8191 | |
| TGFBR1抗体 | Affinity Biosciences | AF5347 | |
| 磷酸化TGFBR1抗体 | Affinity Biosciences | AF8080 | |
| MMP2抗体 | Abcam | ab86607 | |
| COL1A1抗体 | Abcam | ab88147 | |
| COL3A1抗体 | Abcam | ab184993 | |
| TGF-β1抗体 | Abcam | ab215715 | |
| 抗小鼠IgG二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗兔IgG二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 细胞活力检测 | MTT试剂 | Beyotime | ST316 |
| 细胞核染色 | DAPI染色液 | Beyotime | C1002 |
| 细胞染色 | 0.1%结晶紫溶液 | Beyotime | C0121 |
| 磷酸化蛋白质组学 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
| High-Select Fe-NTA磷酸化肽富集试剂盒 | Thermo Scientific | A32992 | |
| 细胞转染 | TGFBR2-HA质粒 | Sino Biological | HG10358-CY |
| TGFBR2激酶死质粒 | Addgene | #11762 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| Smad荧光素酶报告基因分析 | Smad荧光素酶报告质粒 | Yeasen Biotechnology | 11543ES03 |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | RG027 | |
| 免疫荧光 | 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | LSM 800 |
| 激酶活性分析 | 铕标记抗GST抗体 | Life Technologies | -- |
| 激酶示踪物178 | Life Technologies | -- | |
| 384孔板 | -- | -- | |
| DARTS | 链霉蛋白酶 | Coolaber | CP9141 |
| MST | Monolith NT蛋白标记试剂盒RED-NHS | Nanotemper | -- |
| Monolith NT.115仪器 | Nanotemper | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | GemPharmatech Co., Ltd. | -- |
| 异氟烷 | -- | -- | |
| 免疫组化 | DAB显色试剂盒 | Servicebio | G1212 |
| 倒置显微镜 | Olympus | IX70 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 人骨肉瘤细胞系143B、U2OS、SJSA-1和hFOB 1.19成骨细胞的来源、培养基和培养条件（温度、CO2浓度、血清浓度） 阅读提示：见Materials and Methods中的Cells and cell culture |
| 体外药物处理 | BEA的浓度范围（0-10 μM）和处理时间（24-48小时），以及溶剂DMSO的对照处理 阅读提示：见Results中图1、2、3和图例 |
| 信号通路验证 | TGF-β1刺激的浓度和处理时间，以及BEA的浓度 阅读提示：见Results中图2、3以及图例 |
| 靶点结合验证 | DARTS、CETSA、MST实验中使用的细胞或蛋白浓度、BEA浓度、蛋白酶浓度、温度梯度等 阅读提示：见Materials and Methods中DARTS、CETSA、MST部分 |
| 体内动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、细胞注射数量和部位、BEA给药剂量和途径（2.5和5 mg/kg，静脉注射，每天一次）、治疗周期（14天） 阅读提示：见Materials and Methods中的Animal study和Results中图6、7 |