从pEPSCs分化中胚层（ME）
确定分化中胚层是否需要激活TGF-β信号通路
在无血清分化培养基中添加BMP4、Activin A和CHIR99021，将pEPSCs分化2天形成ME。
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在化学成分明确的条件下将猪多能干细胞快速转化为巨噬细胞
Rapid conversion of porcine pluripotent stem cells into macrophages with chemically defined conditions.
实验完整度
高包含体外分化、功能验证（内吞、吞噬、PRRSV感染、LPS刺激）及转录组测序和信号通路机制验证，证据层级多样。
主要模型
猪扩展潜能干细胞（pEPSCs） 猪肺泡巨噬细胞（PAMs） 猪PSC衍生巨噬细胞（pPSCdMs）
重点核对
分化起始细胞类型：pEPSCs，培养于STO饲养层。 分化培养基：StemSpan SFEM II，补充BMP4、Activin A、CHIR99021等。 关键时刻：第2天加入SB431542抑制TGF-β信号，促进HE分化。 细胞因子浓度：如BMP4 25 ng/ml，VEGFA 50 ng/ml等。 分化总时长：11天。
摘要
由多能干细胞（PSCs）衍生的猪巨噬细胞的可再生来源将是原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）在研究宿主-病原体相互作用机制中的重要替代品。我们开发了一种高效且快速的方案，在11天内从猪PSCs（pPSCs）获得巨噬细胞。pPSC衍生的巨噬细胞（pPSCdMs）表现出原代巨噬细胞的分子和功能特征。pPSCdMs表现出巨噬细胞特异性表面蛋白表达和巨噬细胞特异性转录因子，与PAMs相似。pPSCdMs还具有巨噬细胞的功能特征，如内吞、吞噬、猪繁殖与呼吸综合征病毒感染以及对脂多糖刺激的反应。此外，我们对整个分化过程进行了转录组测序，以追踪猪PSCs参与信号通路的命运转变。转化生长因子β信号的激活对于中胚层的形成是必需的，而在造血内皮阶段抑制转化生长因子β信号通路可以增强造血命运转变。总之，我们开发了一种高效且快速的方案来生成pPSCdMs，其功能成熟度与PAMs相当。pPSCdMs可为宿主-病原体相互作用机制的平台提供广阔前景。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发一种快速、化学成分明确的方案从猪多能干细胞中分化出功能性巨噬细胞，并明确TGF-β信号通路在分化过程中的作用？
- 核心机制
- TGF-β信号通路在猪造血分化中具有双重作用：中胚层形成需要TGF-β信号激活，而造血内皮阶段抑制TGF-β信号可增强造血命运转化。
- 主要证据
- 通过RT-qPCR、流式细胞术和RNA-seq证实分化各阶段标志物表达；功能实验表明pPSCdMs具有内吞、吞噬、PRRSV感染和LPS反应能力，与PAMs相似。
- 研究意义
- pPSCdMs可作为研究宿主-病原体相互作用机制的平台，并有助于分析猪与人类巨噬细胞的差异，为减少免疫排斥和异种移植提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
中胚层向造血内皮（HE）分化
确定TGF-β信号抑制对HE形成的影响，并分析CD31+细胞比例
在分化第2天更换为含VEGFA、bFGF、SCF和SB431542的培养基，诱导HE形成。
造血内皮向红系髓系祖细胞（EMP）分化
从HE诱导获得EMP样细胞，并比较TGF-β信号抑制与否对造血效率的影响
换液加入VEGFA、bFGF、SCF、IL-6、FLT3L、TPO和IL-3，培养4天至第9天，收集悬浮EMP。
EMP向成熟巨噬细胞分化
将EMP样细胞进一步分化为功能性巨噬细胞
第9天收集悬浮EMP，在含M-CSF的培养基中培养2天，获得成熟pPSCdMs。
pPSCdMs功能鉴定
评估pPSCdMs是否具有巨噬细胞的功能特征，如内吞、吞噬、PRRSV感染和LPS反应
通过内吞实验、吞噬实验、PRRSV感染和LPS刺激等实验，与PAMs比较功能。
转录组测序及信号通路分析
通过转录组测序分析分化过程中的基因表达动态，并验证TGF-β信号通路的作用
对分化各阶段（pEPSCs、PS、ME、HE、EMP、pPSCdMs）进行总RNA-seq，并进行GO/KEGG富集分析。比较不同TGF-β处理组的基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | CORNING | -- |
| 胎牛血清 | Vistech | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 谷氨酰胺补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 非必需氨基酸 | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| β-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| KnockOut DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | |
| N2添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| B27添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| 维生素C | Sigma-Aldrich | 49752 | |
| XAV939 | Sigma-Aldrich | X3004 | |
| CHIR99021 | Toris | 4423 | |
| WH-4-023 | Toris | 5413 | |
| 激活素A | PeproTech | 120-14E | |
| 白血病抑制因子 | PeproTech | 300-05 | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| RPMI-1640培养基 | CORNING | -- | |
| 分化诱导 | StemSpan SFEM II培养基 | StemCell Technologies | -- |
| 骨形态发生蛋白4 | PeproTech | 120-05ET | |
| 激活素A | Sino Biological | 10429-HNAH | |
| CHIR99021 | MedChemExpress | HY-10182 | |
| 血管内皮生长因子A | Sino Biological | 11066-HNAH | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Sino Biological | 10014-HNAE | |
| 干细胞因子 | Novoprotein | C034 | |
| SB431542 | MedChemExpress | HY-10431 | |
| 白细胞介素-6 | Novoprotein | C009 | |
| FMS样酪氨酸激酶3配体 | Novoprotein | CA82 | |
| 促血小板生成素 | Novoprotein | CJ95 | |
| 白细胞介素-3 | Novoprotein | CX90 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Novoprotein | C417 | |
| 染色 | 吉姆萨染色液 | Beyotime | C0131 |
| RNA提取 | RNAiso Plus 试剂 | Takara | 9108 |
| 逆转录 | HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper） | Vazyme | R323 |
| RT-qPCR | ChamQ SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q311 |
| 免疫荧光 | CD14抗体 | Biorad | MCA1218F |
| CD163抗体 | Biorad | MCA2311F | |
| CD45抗体 | Biorad | MCA1746GA | |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗 Alexa Fluor 488 偶联物 | ZSGB-BIO | -- | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| 显微镜成像 | EVOS M5000显微镜 | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 |
| PRRSV感染 | GFP标记的PRRSV | -- | -- |
| PI染色 | 碘化丙啶 | Solarbio | C0080 |
| LPS诱导 | 脂多糖（大肠杆菌O111:B4） | Sigma-Aldrich | L2630 |
| 流式细胞术 | KDR抗体 | Proteintech | 26415-1-AP |
| CD31抗体 | Biorad | MCA1222GA | |
| CD45抗体 | Biorad | MCA1746GA | |
| CD163抗体 | Biorad | MCA2311F | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 内吞实验 | 四甲基罗丹明-葡聚糖 | Thermo Fisher Scientific | D1818 |
| 吞噬实验 | pHrodo Green E. coli BioParticles 偶联物 | Thermo Fisher Scientific | P35366 |
| 细胞松弛素D | MedChemExpress | HY-N6774 | |
| RNA-seq | Dynabeads Oligo (dT) | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | 1896649 | |
| 大肠杆菌DNA聚合酶I | NEB | m0209 | |
| RNase H | NEB | m0297 | |
| dUTP溶液 | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| 热不稳定UDG酶 | NEB | m0280 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与饲养层制备 | STO饲养层细胞的制备方法、培养条件（培养基、温度、CO2）、丝裂霉素处理时间（12小时）等。 阅读提示：Culturing mouse STO feeder cells |
| pEPSCs培养 | pEPSCs培养基成分（如KO DMEM、N2/B27补充剂、CHIR99021等）、传代方法、饲养层条件。 阅读提示：Culturing porcine EPSCs |
| PAMs培养 | PAMs培养基成分（如RPMI-1640、FBS等）、培养条件（37°C, 5% CO2）。 阅读提示：Culturing PAMs and Marc145 |
| 巨噬细胞分化 | 分化培养基成分、细胞因子及浓度（BMP4 25ng/ml, Activin A 25ng/ml, CHIR99021 6μM, VEGFA 50ng/ml, bFGF 50ng/ml, SCF 50ng/ml, SB431542 10μM等）、换液时间点。 阅读提示：Differentiation of macrophage from pEPSCs |
| PRRSV感染实验 | GFP-PRRSV来源、感染剂量（MOI）、感染时间（12小时）、PI染色条件。 阅读提示：PRRSV infection; PI staining |
| LPS刺激实验 | LPS浓度（200 ng/ml）、处理时间（24小时）。 阅读提示：LPS induction |
| 内吞和吞噬实验 | 葡聚糖浓度（1mg/ml）、孵育时间（30分钟）；E. coli BioParticles浓度（1mg/ml）、孵育时间（3小时）；固定和染色条件。 阅读提示：Endocytosis assay; Phagocytosis assay |
| 转录组测序 | RNA提取方法、文库构建流程、测序平台（NovaSeq 6000）及测序参数（PE150）。 阅读提示：RNA-seq |
| 数据分析 | 比对软件（HISAT2）、组装软件（StringTie）、差异表达分析（DESeq2）、富集分析工具（DAVID）及参数设置。 阅读提示：Bioinformatics |