巨噬细胞极化与ER应激诱导
建立M1样和M2样巨噬细胞模型，并诱导ER应激，以研究不同极化状态的巨噬细胞对ER应激的感知。
使用GM-CSF和M-CSF分别诱导BMDM分化为M1样（GM-BMDM）和M2样（M-BMDM）巨噬细胞，然后用Tm（1 μg/ml）处理不同时间（0、4、6、8、12 h）诱导ER应激。
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巨噬细胞与肿瘤细胞之间的可传递内质网应激塑造肿瘤微环境
Transmissible ER stress between macrophages and tumor cells configures tumor microenvironment.
实验完整度
高包含体外细胞模型（GM-BMDM、M-BMDM、LLC）和3D共培养，结合免疫印迹、RT-qPCR、RNA-seq和蛋白质组学多层级验证，并进行功能验证（细胞死亡）和机制验证（MAPK通路、DAMPs）。
主要模型
GM-CSF培养的骨髓来源巨噬细胞（GM-BMDM，M1样） M-CSF培养的骨髓来源巨噬细胞（M-BMDM，M2样） 小鼠路易斯肺癌细胞系（LLC） 3D共培养体系（肿瘤球）
重点核对
供体巨噬细胞类型（GM-BMDM与M-BMDM）及其极化状态 ER应激诱导剂及浓度（Tm 1 μg/ml，Tg 300 nM） 条件培养基制备和处理时间 受体肿瘤细胞系（LLC） 细胞死亡检测（PI/Hoechst染色）
摘要
内质网（ER）应激启动未折叠蛋白反应（UPR），对肿瘤细胞生长和肿瘤微环境（TME）的维持至关重要。肿瘤细胞持续经历ER应激，并可将其传递给邻近的巨噬细胞及周围环境。肿瘤浸润的巨噬细胞也能适应微环境的变化，通过ER应激来满足其高能量需求和生物学功能。然而，不同的巨噬细胞群体是否差异性地感知ER应激并将其传递给周围的肿瘤细胞，尚未阐明。在此，我们旨在研究可传递性ER应激在TME中作为细胞间通讯的新型调节因子的作用。小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）可极化为称为经典（M1）和替代（M2）激活的不同功能终点，其极化状态已被证明与其功能意义密切相关。我们发现，肿瘤细胞能够从两种不同极化状态的巨噬细胞群体接收到可传递性ER应激，且两者ER应激激活程度不同。促炎性M1样巨噬细胞对ER应激的反应程度较低，但它们能向肿瘤细胞传递更多的ER应激。此外，通过分析两种ER应激巨噬细胞群体的分泌组分，我们鉴定出某些损伤相关分子模式（DAMPs），包括S100A8和S100A9，主要由M1样巨噬细胞分泌，可与传递的ER应激协同导致受体肿瘤细胞显著死亡。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 不同极化状态的巨噬细胞是否差异性感知ER应激并将其传递给肿瘤细胞，以及这种传递对肿瘤细胞命运的影响。
- 核心机制
- M1样巨噬细胞虽感知较少ER应激，但能传递更多ER应激，并释放DAMPs（S100A8/A9），与ER应激协同激活MAPK信号通路（p-JNK、p-p38），诱导肿瘤细胞凋亡和自噬性死亡；而M2样巨噬细胞感知更多但传递较少，并释放抗炎分子，可能促进肿瘤生存。
- 主要证据
- 使用GM-BMDM和M-BMDM作为M1/M2模型，通过条件培养基转移实验、3D共培养、免疫印迹、RT-qPCR、RNA-seq和蛋白质组学，证明ER应激传递和DAMPs释放，以及重组S100A8/A9与ER应激协同诱导LLC死亡。
- 研究意义
- 作者提出不同巨噬细胞群体通过可传递性ER应激重塑TME，M1样巨噬细胞促进肿瘤杀伤，而M2样巨噬细胞可能支持肿瘤进展，为靶向巨噬细胞极化或ER应激传递的肿瘤治疗策略提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
条件培养基转移实验
验证巨噬细胞是否将ER应激传递给肿瘤细胞，并比较不同极化巨噬细胞的传递能力。
收集ER应激巨噬细胞的条件培养基（CM），处理LLC细胞24小时，检测UPR标志物（Grp78、CHOP、sXbp1）的表达。
3D共培养体系验证
在更接近体内TME的3D条件下验证ER stress传递及其对肿瘤细胞的影响。
将巨噬细胞培养在transwell小室中，用Tm处理6小时，洗涤后与3D培养的LLC球体共培养40小时，检测UPR标志物和炎性因子。
细胞死亡检测
评估传递的ER应激对肿瘤细胞存活的影响。
用来自应激巨噬细胞的CM处理LLC细胞36小时，通过PI/Hoechst染色检测细胞死亡，并检测凋亡和自噬标志物。
转录组分析
分析肿瘤细胞对不同巨噬细胞CM响应的基因表达差异。
对用不同CM处理的LLC细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因（DEGs）和GO通路富集。
分泌蛋白组分析
鉴定ER应激巨噬细胞分泌的关键因子，特别是与细胞死亡相关的DAMPs。
对ER应激巨噬细胞的CM进行蛋白质组学分析，鉴定分泌蛋白，并通过ELISA验证S100A8/A9的释放。
DAMP与ER应激协同作用验证
验证DAMPs（S100A8/A9）是否与ER应激协同诱导肿瘤细胞死亡。
用重组S100A8/A9单独或与Tm联合处理LLC细胞，检测细胞死亡和MAPK信号通路激活。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ER应激诱导 | 衣霉素 | Cell Signaling Technology | 12,819 |
| 毒胡萝卜素 | Cell Signaling Technology | 12,758 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 巨噬细胞分化 | 重组小鼠GM-CSF | R&D | 415-ML |
| 重组小鼠M-CSF | R&D | 416-ML | |
| DAMP处理 | 小鼠重组S100A8 | Sino Biological | 50,228-M08B |
| 小鼠重组S100A9 | Sino Biological | 50,284-M07E | |
| RT-qPCR | PrimeScript™ RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR047A |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 4,913,914,001 | |
| 蛋白浓度测定 | BCA蛋白测定试剂盒 | Solarbio Life Sciences | PC0020 |
| 细胞染色 | Hoechst 33342 | Solarbio Life Sciences | C0030 |
| 碘化丙啶 | Solarbio Life Sciences | C0080 | |
| 细胞培养耗材 | 细胞培养小室（0.4 μm） | Millipore | PICM01250 |
| 细胞活力检测 | 发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7570 |
| 3D细胞活力检测 | 3D细胞活力检测试剂盒 | Promega | G9681 |
| 凋亡检测 | Caspase-Glo 3/7检测试剂盒 | Promega | G8091 |
| 细胞毒性检测 | 细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G8741 |
| 免疫印迹 | Grp78抗体 | BD Biosciences | 610978 |
| CHOP抗体 | CST | 2895 | |
| Xbp1抗体 | Abcam | ab220783 | |
| caspase-1抗体 | Abcam | ab179515 | |
| caspase-9抗体 | CST | 9508 | |
| GAPDH抗体 | CST | 5174 | |
| LC3抗体 | CST | 4108 | |
| Beclin-1抗体 | CST | 3495 | |
| p-ULK1抗体 | CST | 5869 | |
| cleaved-PARP抗体 | CST | 9544 | |
| p-JNK抗体 | CST | 4668 | |
| JNK抗体 | CST | 9252 | |
| p-ERK抗体 | CST | 4370 | |
| ERK抗体 | CST | 4695 | |
| p-p38抗体 | CST | 4511 | |
| p38抗体 | CST | 8690 | |
| S100A9抗体 | CST | 73425 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG | Absin | abs20001 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG | Absin | abs20002 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Takara | 9109 |
| RNA定量 | Nanodrop分光光度计 | Thermo Scientific | ND-ONE |
| RT-qPCR | ABI Stepone Plus系统 | -- | -- |
| ELISA | S100A8 ELISA试剂盒 | Cloud Clone | -- |
| S100A9 ELISA试剂盒 | Cloud Clone | -- | |
| S100A8/A9 ELISA试剂盒 | Cloud Clone | -- | |
| RNA-seq | NovaSeq 6000平台 | Illumina | -- |
| 蛋白质谱 | Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| 6460三重四极杆质谱仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 细胞成像 | 高内涵细胞成像仪（Operetta） | PerkinElmer | -- |
| ZEISS Ver.A1显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| Western blot检测 | ECL检测试剂 | Millipore | WBKLS0500 |
| Western blot成像 | Tanon 5200成像系统 | Tanon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 巨噬细胞分化 | BMDM分化条件：GM-CSF浓度20 ng/ml，M-CSF浓度50 ng/ml，培养7天；细胞接种密度 阅读提示：参见Materials and methods: Murine primary BMDM isolation and culture |
| ER应激诱导 | Tm浓度1 μg/ml，Tg浓度300 nM，处理时间0-12小时 阅读提示：参见Materials and methods: Conditioned media preparation; Results: Tumor cells sense transferable ER stress |
| 条件培养基转移 | CM制备：ER应激后洗涤3次，加新鲜培养基，16小时收集；LLC处理时间24小时或36小时 阅读提示：参见Materials and methods: Conditioned media preparation; Results: Tumor cells sense transferable ER stress |
| 3D共培养 | 巨噬细胞在transwell小室中处理6小时，与3D LLC球体共培养40小时；Matrigel基质胶 阅读提示：参见Materials and methods: Co-cultured 3D system; Results: Tumor cells sense transferable ER stress（图S2） |
| 细胞死亡检测 | PI/Hoechst染色时间30分钟；定量方法 阅读提示：参见Materials and methods: The high content imaging analysis system and fluorescence microscope; Results: Transferred ER stress induces LLC tumor cells death |
| 信号通路检测 | Western blot抗体及稀释比；检测p-JNK, p-ERK, p-p38；S100A8/A9处理浓度5 μg/ml 阅读提示：参见Materials and methods: Immunoblotting and antibodies; Results: DAMP signaling acts in synergy with ER stress signaling |