测定系统建立与优化
建立快速体外抑制测定系统，并确定最佳刺突蛋白形式。
将ACE2固定在微流控反应器内，使用四种刺突蛋白形式（RBD、S1、S-ECD单体、S-ECD三聚体）测试抗体抑制ACE2结合的能力。
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SARS-CoV-2中和抗体和纳米抗体的快速定量体外评估
Rapid and Quantitative In Vitro Evaluation of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies and Nanobodies.
实验完整度
高包含方法开发、多种刺突蛋白形式比较、多抗体/纳米抗体验证、假病毒中和试验对照及变体测试。
主要模型
HEK 293T细胞 293T-ACE2细胞 SARS-CoV-2假病毒
重点核对
使用的刺突蛋白形式（S-ECD homotrimer） 抗体和纳米抗体的浓度梯度（起始50 μg/mL，10倍稀释） ACE2蛋白的固定浓度（4 μg/mL） 假病毒中和试验的细胞系（293T-ACE2） IC50的计算方法（线性拟合线性区域）
摘要
中和单克隆抗体和纳米抗体作为COVID-19的潜在治疗药物已显示出有前景的结果。鉴定此类抗体和纳米抗体需要通过生物测定（如病毒中和试验（VNT））评估大量先导分子的中和活性。这些测定通常耗时且对实验室设施要求高。在此，我们提出一种快速定量的测定方法，可在1.5小时内评估抗体或纳米抗体的中和效力，不需要BSL-2设施，每次测定仅消耗8 μL低浓度（ng/mL）样品。我们测试了七种抗体和八种纳米抗体抑制人血管紧张素转换酶2（ACE2）结合的功效，并验证了我们测定的IC50值与SARS-CoV-2假病毒中和试验相当。我们还发现，我们的测定可以评估针对三种广泛传播的SARS-CoV-2变体的中和效力。我们观察到这些变体与ACE2的亲和力增加，包括Beta和Gamma变体。最后，我们证明了我们的测定能够利用一组已知结合表位的纳米抗体快速鉴定SARS-CoV-2刺突蛋白的免疫逃逸突变。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何快速定量评估SARS-CoV-2中和抗体和纳米抗体的中和活性？
- 核心机制
- 基于竞争性抑制SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2结合的机制，利用S-ECD三聚体模拟病毒表面刺突蛋白的生理构象。
- 主要证据
- 通过RIVIA测试多种抗体和纳米抗体，并与假病毒中和试验对比，证明S-ECD三聚体可取得与pVNA相当的结果，且能评估变体。
- 研究意义
- 提供了一种快速、定量、低成本的抗体筛选方法，可用于快速评估新变异株的中和效力，促进疗法开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗体和纳米抗体的中和效力评估
验证RIVIA能否准确评估不同抗体和纳米抗体的中和活性。
使用优化的S-ECD三聚体测定，测试了多种抗体（R001、MM43、MM57、CB6、AS35、CR3022、D006）和纳米抗体Fc融合蛋白（Nb21、mNb6、Nb93、Nb34、KC3.ep3、Nb95、VHH-72等）。
评估SARS-CoV-2变体的中和效力
测试RIVIA对三种流行变异株（Alpha、Beta、Gamma）的中和评估能力。
使用生物素化的S-ECD三聚体变异蛋白（Alpha、Beta、Gamma）测试相同抗体和纳米抗体的抑制效果。
筛选免疫逃逸突变
利用已知表位的纳米抗体筛查Beta变体的免疫逃逸突变。
比较四种结合不同RBD表位的纳米抗体（Nb21、Nb34、Nb93、Nb95）对野生型和Beta变异S-ECD的抑制能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 测定缓冲液 | 1× PBS缓冲液 | R&D Systems | DY006 |
| 封闭缓冲液 | 10% BSA缓冲液 | R&D Systems | SLBR9934V |
| 洗涤缓冲液 | 洗涤缓冲液浓缩液 | R&D Systems | WA126 |
| 检测试剂 | 链霉亲和素多聚辣根过氧化物酶 | Thermo Fisher | PI21140 |
| 稀释缓冲液 | 多聚HRP稀释缓冲液 | Thermo Fisher | ENN500 |
| 化学发光底物 | SuperSignal™ ELISA Femto底物 | Thermo Fisher | 37075 |
| 洗涤用蒸馏水 | UltraPure™无DNase/RNase蒸馏水 | Thermo Fisher | 10977023 |
| 封闭缓冲液 | SuperBlock™ (PBS)缓冲液 | Thermo Fisher | 37515 |
| 捕获蛋白 | 人重组ACE2蛋白（hFc标签） | Sino Biological | 10108-H02H |
| 竞争蛋白 | SARS-CoV-2 (2019-nCoV)刺突RBD-His重组蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H |
| SARS-CoV刺突/S1蛋白（S1亚基，His标签） | Sino Biological | 40150-V08B1 | |
| 重组SARS-CoV-2刺突His蛋白 | R&D Systems | 10549-CV | |
| 重组SARS-CoV-2刺突GCN4-IZ His蛋白 | R&D Systems | 10561-CV | |
| 重组SARS-CoV-2 B.1.351刺突GCN4-IZ His蛋白 | R&D Systems | 10786-CV | |
| 重组SARS-CoV-2 B.1.1.7刺突GCN4-IZ His蛋白 | R&D Systems | 10796-CV | |
| 重组SARS-CoV-2 P.1刺突GCN4-IZ His标签蛋白 | R&D Systems | 10795-CV | |
| 生物素化 | EZ-Link™ NHS-PEG4-生物素 | Thermo Fisher | 21330 |
| 抗体 | 人源化嵌合抗体D006 | Sino Biological | 40150-D006 |
| 中和抗体MM43（小鼠单克隆抗体） | Sino Biological | 40591-MM43 | |
| MM57（小鼠单克隆抗体） | Sino Biological | 40592-MM57 | |
| 中和抗体R001（兔单克隆抗体） | Sino Biological | 40592-R001 | |
| 抗SARS-CoV-2刺突RBD中和抗体人IgG3（AS35） | Acro Biosystems | SAD-S35 | |
| 中和抗体CB6（人） | In-house | -- | |
| CR3022（人） | In-house | -- | |
| 纳米抗体 | KC3.ep3 | In-house | -- |
| Ty1 | In-house | -- | |
| VHH-72 | In-house | -- | |
| Nb系列 | In-house | -- | |
| 假病毒浓缩 | Lenti-X浓缩器 | Takara | 631232 |
| 细胞培养 | Lenti-X 293T细胞 | Takara | 632180 |
| 假病毒检测 | 荧光素酶底物（ONE-Glo） | Promega | E6110 |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | -- | -- |
| 假病毒制备 | HDM-Hgpm2质粒 | BEI Resources | NR-52517 |
| HDM-tat1b质粒 | BEI Resources | NR-52518 | |
| pRC-CMV-Rev1b质粒 | BEI Resources | NR-52519 | |
| pHAGE-CMV-Luc2-IRES-ZsGreen-W | BEI Resources | NR-52516 | |
| pCMV3 SARS-CoV2 S Untagged Delta 19AA C-term质粒 | -- | -- | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 细胞感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 信号检测 | 酶标仪（Molecular Devices SpectraMax） | Molecular Devices | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RIVIA测定 | ACE2浓度、刺突蛋白形式及浓度、抗体稀释及孵育时间 阅读提示：Methods第3、4节及Figure S1 |
| 假病毒中和试验 | 细胞系、转染质粒、假病毒制备条件、中和试验条件 阅读提示：Methods第6节 |
| 变体评估 | S-ECD三聚体变异蛋白浓度、抗体稀释 阅读提示：Results第3节及Figure 4 |