动物感染与样本采集
建立SARS-CoV-2感染恒河猴模型并获取用于分析的肺和肠道组织。
5只恒河猴鼻内接种SARS-CoV-2-KMS1/2020，3只健康猴作为对照。在3, 7, 10 dpi收集肺和小肠组织。
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纵向分析揭示SARS-CoV-2感染的恒河猴肺和肠道组织中不同的免疫应答景观
Longitudinal analyses reveal distinct immune response landscapes in lung and intestinal tissues from SARS-CoV-2-infected rhesus macaques.
实验完整度
中研究包含体内感染模型、scRNA-seq、流式、IHC、IF等多种实验方法，但样本量小，缺乏独立验证。
主要模型
SARS-CoV-2感染的恒河猴 肺组织 小肠组织
重点核对
恒河猴: 5只8-12月龄雄性，体重2-3kg，鼻内接种SARS-CoV-2-KMS1/2020，剂量2×10^5 TCID50 对照组: 3只健康雄性恒河猴，年龄体重匹配 感染时间点: 3, 7, 10 dpi 组织: 肺和小肠，分别有6和8个样本进行分析
摘要
COVID-19个体的病理和免疫应答在肺和肠道中表现出不同的动态变化。在此，我们描绘了SARS-CoV-2感染的猴子在感染后3至10天纵向收集的肺和肠道组织样本的单细胞转录图谱。我们发现肠道肠上皮细胞在感染后3天发生退化，但迅速恢复，表明感染对肠道的影响轻微。至关重要的是，我们观察到肠道中B细胞和潘氏细胞积累相关的炎症反应和组织损伤受到抑制，尽管T细胞在SARS-CoV-2感染中被激活。与肺相比，肠道中干扰素应答相关基因的表达受到抑制，炎症因子分泌减少。我们的发现表明SARS-CoV-2感染期间肠道黏膜免疫动态失衡，这可能构成持续的直肠病毒脱落和轻微组织损伤的基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2感染恒河猴后，肺和肠道组织中的免疫应答如何不同？
- 核心机制
- 肠道中IFN应答基因表达抑制，B细胞和潘氏细胞介导的炎症抑制有助于维持肠道屏障，但可能导致持续病毒脱落。
- 主要证据
- scRNA-seq揭示肺中炎症细胞积累和免疫激活，而肠道中肠细胞恢复、B细胞和潘氏细胞积累，但IFN相关通路下调。
- 研究意义
- 研究为理解COVID-19中肠道免疫反应和持续病毒脱落机制提供了见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析
描绘肺和肠道组织在感染过程中的细胞组成和转录变化。
从肺和肠道组织制备单细胞悬液，进行scRNA-seq，鉴定细胞类型并分析动态变化。
T细胞亚群分析
研究肺和肠道中T细胞亚群的动态变化和激活状态。
对scRNA-seq数据中T细胞进行亚聚类，分析不同亚群比例变化和激活标志物表达，并通过免疫荧光验证。
B细胞和潘氏细胞分析
分析B细胞和潘氏细胞在肠道中的积累及其与炎症抑制的关系。
通过scRNA-seq和免疫荧光分析B细胞和潘氏细胞数量变化，GO分析其功能通路，并检测相关基因表达。
髓系细胞分析
探究肺和肠道中髓系细胞的亚群变化和功能状态。
对scRNA-seq数据中单核细胞、巨噬细胞、DC和NK细胞进行亚聚类分析，并评估IFN相关通路活性。
ACE2和TMPRSS2表达分析
确定肺和肠道中病毒进入受体的表达分布。
通过scRNA-seq分析ACE2和TMPRSS2在不同组织细胞中的表达，并比较ACE2+和ACE2-细胞的IFN应答。
炎症因子分析
比较肺和肠道中炎症因子和趋化因子的表达动态。
使用scRNA-seq和细胞因子微球阵列检测组织和蛋白水平的炎症因子表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒培养和滴定 | DMEM培养基 | Sigma | d8371 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| qRT-PCR | TRIzol总RNA提取试剂 | TianGen | DP424 |
| One Step PrimeScript RT-PCR试剂盒 | TaKaRa | RR064A | |
| 组织匀浆 | 铁珠 | Solarbio | YA3031 |
| 免疫组织化学 | 金属增强DAB底物试剂盒 | Solarbio | DA1015 |
| 通用两步检测试剂盒 | ZSGB-BIO | PV-9000 | |
| 免疫荧光 | 抗CD3抗体 | ImmunoWay | YT0761 |
| 抗CD38抗体 | Proteintech | 60006-1-Ig | |
| 抗CD69抗体 | Proteintech | 10803-1-AP | |
| 抗CD74抗体 | Cell Signaling Technology | 77274S | |
| 抗颗粒酶B抗体 | ImmunoWay | YM4028 | |
| 抗CD20抗体 | ThermoFisher Scientific | MA1-10135 | |
| 抗CD16抗体 | Abcam | ab246222 | |
| 抗CD1c抗体 | Biolegend | 331502 | |
| 抗CD163抗体 | Abcam | ab182422 | |
| ZO-1抗体 | ThermoFisher Scientific | 33-9100 | |
| 抗Claudin 1抗体 | Abcam | ab211737 | |
| IFN-γ抗体 | R&D systems | AF-285-NA | |
| Alexa Fluor 488标记驴抗山羊IgG | ThermoFisher Scientific | A11055 | |
| Alexa Fluor 555标记山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab150114 | |
| Alexa Fluor 647标记驴抗兔IgG | Abcam | ab150075 | |
| DAPI | Abcam | ab104139 | |
| 柠檬酸钠缓冲液 | Solarbio | C1010 | |
| Triton X-100 | BioFrox | 1139ML500 | |
| 吐温20 | BioFrox | 1247ML500 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A1933 | |
| Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 流式细胞术 | NHP T/B/NK细胞混合抗体 | BD Biosciences | 558639 |
| PerCP-Cy5.5标记小鼠抗人CD3 | BD Biosciences | 552852 | |
| Brilliant Violet 421标记抗人CD19抗体 | BioLegend | 302234 | |
| FITC标记抗人CD14抗体 | BioLegend | 301804 | |
| PE标记小鼠抗人CD56 | BD Biosciences | 556647 | |
| PE/Cyanine7标记抗人HLA-DR抗体 | BioLegend | 307616 | |
| PE/Cyanine7标记抗人CD163抗体 | BioLegend | 333614 | |
| CytoFlex流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 单细胞RNA测序 | GEXSCOPE单细胞RNA扩增和文库构建试剂盒 | Singleron | 1110011LA1 |
| GEXSCOPE单细胞条形码磁珠试剂盒 | Singleron | 1110011SB2 | |
| GEXSCOPE单细胞微流控芯片和洗涤缓冲液套装 | Singleron | 1110011MC3 | |
| GEXSCOPE组织保存液 | Singleron | SN154211 | |
| GEXSCOPE组织解离液 | Singleron | SN421201 | |
| 人淋巴细胞分离液 | Solarbio | P8610 | |
| 胰蛋白酶-EDTA溶液 | SIGMA | T4049 | |
| 无RNA酶水 | TAKARA | 9012 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-040-CVC | |
| Illumina NovaSeq平台 | Illumina | -- | |
| 细胞因子检测 | 非人灵长类细胞因子磁珠检测试剂盒 | Millipore | PRCYTOMAG-40K, PCYTMG-40K-PX23, PRCYMAG40PMX23BK |
| Luminex 200液相芯片系统 | Luminex | -- | |
| 病毒检测 | SARS-CoV-2核衣壳蛋白兔单克隆抗体 | Sino Biological | 40143-R001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物感染 | 恒河猴数量: 感染组5只，对照组3只；年龄8-12个月；体重2-3kg；性别: 雄性；病毒株: SARS-CoV-2-KMS1/2020；感染剂量: 2×10^5 TCID50；感染途径: 鼻内接种 阅读提示：STAR Methods - Animal study |
| 病毒感染和滴定 | Vero细胞培养条件；病毒滴度测定方法 阅读提示：STAR Methods - Virus and cells; Viral titer detection |
| 单细胞RNA测序 | 组织解离条件；scRNA-seq建库试剂盒；测序平台；数据过滤参数（>200 genes, <50% mitochondrial genes） 阅读提示：STAR Methods - Preparation of single-cell suspensions; Cell preparation for 3′ barcoded single-cell RNA-seq; scRNA-seq data processing and quality control |
| 免疫荧光 | 抗体浓度；抗原修复条件；成像系统 阅读提示：STAR Methods - Immunofluorescence (IF) |
| 细胞因子检测 | 使用的试剂盒；检测仪 阅读提示：STAR Methods - Multiplex cytokine analysis |