表面组 CRISPRa 筛选
鉴定能够结合 SARS-CoV-2 刺突蛋白的宿主表面蛋白。
生成覆盖约 6000 个表面蛋白基因的 CRISPRa 文库，转导 A375 细胞，用刺突 S1-Fc 染色并分选高结合细胞，测序 sgRNA。
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LRRC15 反式抑制 SARS-CoV-2 进入细胞
LRRC15 inhibits SARS-CoV-2 cellular entry in trans.
实验完整度
高包含 CRISPRa 筛选、细胞结合实验、ELISA、假病毒和活病毒进入实验、共培养反式抑制实验及人肺单细胞和 bulk RNA-seq 数据分析，具有多层级功能与机制验证。
主要模型
A375 细胞 HeLa 细胞及 HeLa-ACE2 细胞 Huh7.5 细胞 HEK293T-ACE2/TMPRSS2 细胞
重点核对
CRISPRa 筛选使用 A375 细胞，sgRNA 文库覆盖约 6000 个表面蛋白基因 LRRC15 与刺突蛋白 RBD 直接结合，KD 约 109 nM（ELISA） 假病毒进入实验在 HeLa-ACE2、Huh7.5 细胞中进行，LRRC15 诱导显著抑制进入 活病毒实验使用 icSARS-CoV-2 mNG，MOI=1，感染 24 小时 反式抑制实验使用 HeLa-ACE2 与 HeLa-sgLRRC15 共培养，比例 1:4
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 感染由进入受体血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 介导。尽管促进进入的附着因子和辅助受体已被广泛研究，但抑制病毒进入的细胞进入因子在很大程度上是未知的。通过 surfaceome CRISPR 激活筛选，我们鉴定了人类 LRRC15 作为 SARS-CoV-2 进入的抑制性附着因子。LRRC15 直接与刺突蛋白的受体结合域 (RBD) 以中等亲和力结合，并抑制刺突介导的进入。对人类肺单细胞 RNA 测序数据集的分析显示，LRRC15 的表达主要在成纤维细胞中检测到，特别是在 COVID-19 患者的病理成纤维细胞中富集。ACE2 和 LRRC15 在肺中不在同一细胞类型中共表达。引人注目的是，在 ACE2 阴性细胞中表达 LRRC15 会反式阻断刺突介导的病毒进入 ACE2+ 细胞，表明 LRRC15 在生理背景下具有保护作用。因此，LRRC15 代表了 SARS-CoV-2 的一种抑制性附着因子，以反式方式调节病毒进入。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找并鉴定抑制 SARS-CoV-2 进入的宿主细胞因子，并探究其作用机制。
- 核心机制
- LRRC15 作为一种抑制性附着因子，通过直接结合刺突蛋白的 RBD 将病毒颗粒隔离在细胞表面，阻止其内化，从而抑制 ACE2 介导的病毒进入，且不竞争 ACE2 结合。
- 主要证据
- 表面组 CRISPRa 筛选鉴定出 LRRC15；ELISA 和流式细胞术证明 LRRC15 与刺突 RBD 直接结合；假病毒和活病毒实验证明 LRRC15 抑制 ACE2 介导的进入；共培养实验证明 LRRC15 反式抑制病毒进入。
- 研究意义
- LRRC15 可能是 COVID-19 治疗开发的潜在靶点，并有助于理解宿主与冠状病毒之间的相互作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LRRC15-刺突蛋白结合验证
验证 LRRC15 与刺突蛋白的直接相互作用及其结合结构域。
在 A375 和 HeLa 细胞中诱导 LRRC15 表达，检测刺突蛋白结合；使用重组蛋白进行 ELISA 结合实验。
假病毒进入抑制实验
验证 LRRC15 对刺突介导病毒进入的抑制作用。
使用携带 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 VSV 假病毒感染 LRRC15 诱导的 HeLa-ACE2 和 Huh7.5 细胞，检测 GFP 阳性细胞比例。
活病毒抑制实验
验证 LRRC15 对活 SARS-CoV-2 感染的抑制作用。
使用表达 mNeonGreen 的 SARS-CoV-2 (icSARS-CoV-2 WA01 mNG) 感染 LRRC15 诱导的 HeLa-ACE2 和 Huh7.5 细胞，检测荧光阳性细胞比例。
病毒附着与内化分析
探究 LRRC15 抑制病毒进入的机制。
在冰上孵育假病毒与细胞，通过 RT-qPCR 和免疫荧光检测病毒附着；在 37°C 孵育后观察内化。
反式抑制实验
验证 LRRC15 在 ACE2 阴性细胞上表达时能否抑制邻近 ACE2 阳性细胞的病毒感染。
将 HeLa-ACE2 细胞与 HeLa-sgLRRC15 细胞共培养，感染假病毒，检测 ACE2+ 细胞的 GFP 阳性率。
人肺组织表达分析
分析 LRRC15 在人肺中的表达模式及其与 COVID-19 的相关性。
利用公开 scRNA-seq 和 bulk RNA-seq 数据集，分析 LRRC15 在不同细胞类型中的表达及其与临床特征、病毒载量的关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良 Eagle 培养基 | Gibco | 11995-081 |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| CRISPRa 筛选 | pXPR_502 载体 | Addgene | 96923 |
| pLenti-dCas9-VP64-Blast 载体 | Addgene | 61425 | |
| SARS-CoV-2 刺突 S1 亚基-Fc 融合蛋白 | R&D Systems | 10623-CV-100 | |
| 流式细胞术 | PE 标记的抗人 IgG 抗体 | Southern Biotech | 9040-09 |
| BV421 标记的抗 hCD45 抗体 | BioLegend | 368522 | |
| CRISPR 筛选 | QIAamp DNA Maxi 试剂盒 | Qiagen | 51104 |
| Titanium Taq DNA 聚合酶 | Takara | 639209 | |
| AMPure XP 磁珠 | Beckman Coulter | MSPP-A63880 | |
| NextSeq550 测序仪 | Illumina | -- | |
| 流式细胞术 | RBD-Fc 融合蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H |
| NTD-Fc 融合蛋白 | Sino Biological | 40591-V49H | |
| 全长刺突蛋白 | BEI Resources | NR-53937 | |
| 抗 6xHis 抗体 | Thermo Scientific | MA1-135 | |
| FITC 标记的抗小鼠 IgG1 | BD | 553443 | |
| 山羊抗 ACE2 抗体 | R&D Systems | AF933 | |
| 兔抗 LRRC15 抗体 | Abcam | ab150376 | |
| AF647 标记的驴抗山羊 IgG | Invitrogen | A32849 | |
| AF488 标记的山羊抗兔 IgG | Invitrogen | A32731 | |
| FACSCelesta 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Cytek Aurora 光谱分析仪 | Cytek Biosciences | -- | |
| ELISA | Immulon 2HB 平底板 | Thermo | -- |
| C 端组氨酸标记的刺突蛋白 | BEI Resources | NR-55438, | |
| Hank's 平衡盐溶液 | Gibco | 14025-092 | |
| ACE2-Fc 融合蛋白 | Sino Biological | 10108-H02H | |
| LRRC15-Fc 融合蛋白 | Sino Biological | 15786-H02H | |
| 山羊抗人 IgG Fc 二抗，HRP | Thermo | A18817 | |
| TMB 底物 | Thermo Scientific | ENN301 | |
| 终止液 | Thermo Scientific | PIN600 | |
| BioTek synergy HT 酶标仪 | BioTek | -- | |
| LRRC15-His 蛋白 | AcroBio | LR5-H52H3 | |
| SARS-CoV-2 刺突 RBD-Fc 重组蛋白 | Sino Biological | 40592-V02H | |
| SARS-CoV-2 刺突 S1 NTD-Fc | Sino Biological | 40591-V41H | |
| ACE2-His 蛋白 | Sino Biological | 10108-H08H | |
| SARS-CoV 刺突/RBD 蛋白片段 | Sino Biological | 40150-V31B2 | |
| 山羊抗兔 IgG-HRP 偶联物 | Southern Biotech | 4030-05 | |
| C 端组氨酸标记的 SARS-CoV-2 刺突蛋白 | BEI Resources | NR-53589 | |
| C 端组氨酸标记的 SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 刺突蛋白 | BEI Resources | NR-53947 | |
| 假病毒生产 | Lipofectamine2000 转染试剂 | Invitrogen | -- |
| rVSVΔG*G-GFP 病毒 | Kerafast | EH1019-PM | |
| 抗 VSV-G 抗体 | Sigma | MABF2337 | |
| 假病毒进入实验 | 甲磺酸卡莫司他 | Sigma | -- |
| 活病毒感染实验 | Cytation 5 高内涵成像系统 | BioTek | -- |
| 病毒附着实验 | TRIzol 试剂 | -- | -- |
| RT-qPCR | Direct-zol-96 RNA 试剂盒 | Zymo Research | -- |
| ImProm-II 反转录系统 | Promega | -- | |
| SYBR 染料 | -- | -- | |
| PrimeTime qPCR 检测试剂盒 | IDT | ACTB: | |
| 显微镜分析 | 8 孔腔室玻片 | Nunc | -- |
| 重组抗 LRRC15 抗体 | Abcam | ab150376 | |
| SARS-CoV-2 刺突抗体 [1A9] | GeneTex | GTX632604 | |
| Alexa Fluor 555 偶联的山羊抗兔 IgG 抗体 | Abcam | ab150078 | |
| FITC 偶联的大鼠抗小鼠 IgG1 抗体 | BD | 553443 | |
| 鬼笔环肽-iFluor 647 试剂 | Abcam | 176759 | |
| ProLong Glass 抗淬灭封片剂（含 NucBlue 染色） | -- | -- | |
| Olympus FV3000 共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| 流式细胞术 | 纯化的人 ACE2 抗体 | BioLegend | 375801 |
| CD209 抗体 | BioLegend | 330102 | |
| 山羊抗大鼠 IgG，Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A48263 | |
| 山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher | A32731TR | |
| 干扰素刺激 | 通用 I 型干扰素 | R&D Systems | 11200-1 |
| 干扰素-λ2 | R&D Systems | 8417-IL-025/CF |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPRa 筛选 | A375 细胞，表面积约 6000 个基因的 sgRNA 文库，4 个 sgRNA/基因，1000 个非靶向对照，MOI ~0.3，刺突 S1-Fc 浓度 50 μg/mL，分选荧光强度前 3% 细胞 阅读提示：Methods: CRISPR activation screen for SARS-CoV-2 spike binding |
| 结合实验 | A375 和 HeLa 细胞，LRRC15 诱导方式（sgRNA 或 cDNA 过表达），刺突蛋白浓度（S1-Fc 50 μg/mL，RBD-Fc 200 μg/mL，NTD-Fc 200 μg/mL），ELISA 包被蛋白浓度（2 μg/mL） 阅读提示：Methods: Flow cytometry, ELISA binding assay |
| 假病毒进入实验 | 细胞密度（1×10^5/孔 24 孔板或 2×10^4/孔 96 孔板），假病毒加入体积（150 μL 或 50 μL），感染时间（1 h），检测时间（20 h 后 GFP） 阅读提示：Methods: Pseudovirus entry assay |
| 活病毒感染实验 | 细胞密度（3×10^6/孔 384 孔板），MOI=1，感染时间 24 h，检测 mNeonGreen 阳性细胞 阅读提示：Methods: SARS-CoV-2 mNeonGreen virus infection assay |
| 病毒附着实验 | 细胞数 2×10^5，假病毒体积 150 μL，冰上孵育 1 h，洗涤 3 次，RT-qPCR 检测 VSV-N mRNA 阅读提示：Methods: Pseudovirus attachment assay |
| 反式抑制实验 | 共培养比例（1:4 或 1:1），细胞数量（4×10^3 HeLa-ACE2 + 1.6×10^4 其他，或 1×10^4 + 1×10^4），假病毒体积 50 μL，感染 1 h，检测 20 h 阅读提示：Methods: Trans-inhibition assay |